膠乳散射免疫比濁法檢測(cè)脂蛋白磷脂酶A2方法學(xué)評(píng)價(jià)

張晨

（南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 江蘇 南通 226600）

脂蛋白相關(guān)性磷脂酶A2是磷脂酶A2超家族的成員。循環(huán)中的脂蛋白相關(guān)性磷脂酶A2（Lp-PLA2）是一種主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的反映血管炎癥的特異性標(biāo)記物，在低密度脂蛋白的氧﹑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化以及冠心病和卒中的形成等方面發(fā)揮重要作用[1]。脂蛋白相關(guān)性磷脂酶A2水平升高是預(yù)測(cè)冠心病和卒中風(fēng)險(xiǎn)的一種獨(dú)立危險(xiǎn)因子。因此近年來(lái)相關(guān)研究不斷，為了常規(guī)開展Lp-PLA2檢測(cè)，最大程度地應(yīng)用于臨床，我們參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）的相關(guān)文件[2]，對(duì)乳膠散射免疫比濁法檢測(cè)Lp-PLA2進(jìn)行臨床應(yīng)用前方法學(xué)評(píng)價(jià)與驗(yàn)證，以期待選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的試劑和方法能應(yīng)用于臨床[3]。

1.對(duì)象和方法

1.1 檢測(cè)對(duì)象

本院住院人群及正常體檢人群血清。

1.2 儀器

NORMAN系列散射比濁分析儀（NORMAN-1）、NRM411全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光定量分析儀。

1.3 試劑

NORMAN脂蛋白相關(guān)性磷脂酶A2試劑盒（乳膠散射免疫比濁法）。其中R1∶200mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.5～9.0）﹑0.5%聚乙二醇600。R2∶200mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.5～9.0﹑1.9g/L膠乳和0.095g/L脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）抗體。質(zhì)控品、校準(zhǔn)品為南京諾爾曼惠贈(zèng)。

1.4 樣本采集與處理

血清用普通血清管﹑快速血清管或惰性分離膠促凝管收集。血漿用肝素鈉抗凝。樣本采集后應(yīng)立即使用，若不能立即使用則2～8℃保存，在12小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，血清樣本在-20℃保存穩(wěn)定一個(gè)月內(nèi)使用。待測(cè)的樣本中不能出現(xiàn)沉淀，如有沉淀出現(xiàn)，必須先做離心處理。加熱滅活樣本﹑溶血樣本都應(yīng)棄用。檢測(cè)前樣本必須恢復(fù)至室溫。冷凍保存的樣本需完全融化﹑復(fù)溫﹑混合均勻后方可使用。血清樣本切記反復(fù)凍融，血漿樣本應(yīng)避免冷凍。

1.5 檢測(cè)方法

a、散射比濁法是按照試劑盒操作。加試劑R1 240ul于樣品反應(yīng)杯中，然后加入血清和血漿12ul,混勻，等反應(yīng)杯中的散射光強(qiáng)度穩(wěn)定后，加入試劑R2 60ul混勻，在一分鐘之內(nèi)，測(cè)定散射光強(qiáng)度的變化率。同時(shí)對(duì)兩個(gè)水平的質(zhì)控品進(jìn)行測(cè)定。b、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)是外送樣本至南京諾爾曼公司檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以 表示，組間含量比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)[M(P25，P75)]表示，組間及兩兩比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。評(píng)價(jià)線性和相關(guān)性時(shí)，用相關(guān)與回歸分析。符合雙變量正態(tài)分布的資料選用Spearman秩相關(guān)。偏倚分析采用Bland-Altman方法，以兩比較方法的均值作為X軸，差值作為Y軸。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 選用同一家廠家化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行比對(duì)測(cè)量，使用濃度在50ng/ml～800ng/ml間12個(gè)不同濃度血清樣本進(jìn)行測(cè)定比對(duì)，檢測(cè)線性范圍為100～480ng/ml，相關(guān)系數(shù)r＞0.98，相對(duì)偏差＜18%，最低檢測(cè)限＜89.2ng/ml。

2.2 干擾試驗(yàn)

是在待測(cè)血清中加入一定量的膽紅素、血紅蛋白、或乳糜血中，在Lp-PLA2濃度為150 ng/ml是使得膽紅素濃度＞0.1g/L、血紅蛋白＞1.2g/L、脂血（甘油三酯）＞1.0g/L測(cè)定。記錄結(jié)果，顯示三種濃度下，結(jié)果偏差分別為8ng/ml、9ng/ml、12ng/ml，計(jì)算偏差均小于8%。

1.3 選擇20份濃度在100～480ng/ml的不同樣本，用同一批次試劑進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，計(jì)算變異系數(shù)，最高CV＜7.5%，最低CV＜2.3%。用不同批次試劑進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，每月完成1批檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)在6個(gè)月之內(nèi)完成，合計(jì)6次。計(jì)算檢測(cè)值變異系數(shù)，批間差最高CV＜9.2%，最低CV＜2.8%。

3.討論

脂蛋白磷脂酶A2是臨床實(shí)驗(yàn)室近期開展較多的項(xiàng)目，但方法學(xué)往往集中在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）或膠乳凝集法，但方法學(xué)有一定缺陷，如時(shí)間長(zhǎng)、定量結(jié)果不準(zhǔn)確等[4]。乳膠散射免疫比濁法定量可廣泛應(yīng)用于生化分析儀，具有方便快捷、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，因此收到臨床實(shí)驗(yàn)室人員的青睞。

由結(jié)果2.1顯示該方法檢測(cè)具有較好的相關(guān)性。表明與試劑盒表明相符。結(jié)果2.1與結(jié)果2.3顯示：乳膠散射免疫比濁法線性范圍與ELISA相當(dāng)，但重復(fù)性較文獻(xiàn)報(bào)道為好[5]。結(jié)果2.2顯示，干擾試驗(yàn)與ELISA和膠乳凝集無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，偏差能夠滿足臨床需求。有結(jié)果2.3顯示，相關(guān)偏差最大小于7.5%和9.2%，小于試劑規(guī)定的8%和12%，滿足臨床需求。方法學(xué)檢測(cè)線性范圍較熒光法或化學(xué)發(fā)光法為窄，超出部分需要稀釋檢測(cè)，為該方法不足之處。[6]

綜上所述，使用脂蛋白磷脂酶A2檢測(cè)試劑盒定量測(cè)定人血清或血漿中脂蛋白磷脂酶A2（Lp-PLA2）含量的乳膠散射免疫比濁法正確度﹑靈敏度較高，可重復(fù)性及穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單快速。相應(yīng)的方法學(xué)參數(shù)符合試劑盒規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)和要求，能夠滿足臨床需求。

[1]趙潔，吳俊，賈玫.冠心病患者血液脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2與超敏C反應(yīng)蛋白及D一二聚體的相關(guān)性研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，37(3):227-229.

[2]CLSI.Evaluation of precision of quantitative measurement procedures;approved guide line-third edition(EP05-A3)[S].2014.[3]張秀明，范勇利，溫冬梅，等.臨床化學(xué)自建檢測(cè)系統(tǒng)性能確認(rèn)的精密度與正確度及準(zhǔn)確度的研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，39(9):713-715.

[4]賈珂珂，秦雁飛，楊碩，等.脂蛋白（a）顆粒濃度測(cè)定方法與2種脂蛋白（a）質(zhì)量濃度測(cè)定方法的比較及臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017，32(7):570-576.

[5]李妍，曾歐，李琳，等.冠心病患者血清CysC、Lp-PLA2、MMP-9、PAI-1水平變化及臨床意義[J].山東醫(yī)藥，2016，56(33):5-7.

[6]謝海濤，湯永平，解巧麗，等.脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2免疫熒光層析法的建立及臨床應(yīng)用[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2017，45(9):523-527.