95%酒精固定蛋白甘油凝集法細(xì)胞塊的制備

陳楊 劉盛均

（綿陽(yáng)市中心醫(yī)院病理科 四川 綿陽(yáng) 621000）

細(xì)胞塊技術(shù)是將可疑病變的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中單個(gè)細(xì)胞富集成團(tuán)、固定脫水處理制作成細(xì)胞團(tuán)蠟塊，進(jìn)一步HE切片染色、免疫組化染色等的新技術(shù)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道主要方法有瓊脂包埋法、固定沉淀法、血漿凝血酶沉淀法、雞蛋清凝集法等，方法各有優(yōu)劣[1-5]。根據(jù)自身?xiàng)l件及臨床要求，本科室摸索出了95%酒精固定蛋白甘油凝集法細(xì)胞塊技術(shù)，該法操作簡(jiǎn)單，成本低，效果理想，現(xiàn)介紹如下。

1.材料與方法

1.1 材料

脫落細(xì)胞學(xué)、細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)等病理細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑

斜角式低速離心機(jī)，10ml離心管，2ml吸管，蛋白甘油，95%酒精。

1.3 方法

1.3.1 蛋白甘油制備：取新鮮雞蛋的蛋清至于燒杯中。按7：3比例加入甘油，以玻璃棒充分混勻，攪拌至均勻泡沫狀，放置于冰箱冷藏室過(guò)夜。去除表面凝結(jié)浮沫，收集下部澄清液于200ml滴管瓶，置于4～8攝氏度冰箱保存。每100ml可加入0.5g麝香草酚以防腐。

1.3.2 液基細(xì)胞學(xué)制片后剩余的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，靜置2小時(shí)后，傾去多余上清液，留10～20ml標(biāo)本液，震蕩混勻，將細(xì)胞懸液移至10ml離心管，2500r/min離心5min。

1.3.3 緩慢傾去上清液，加入2ml的95%酒精，若細(xì)胞沉淀較少則加入2滴蛋白甘油，用吸管吹打混勻后完全吸入吸管，倒立使細(xì)胞懸液完全收集于吸管頭，編號(hào)后剪去吸管尖多余部分，放入離心機(jī)4000r/min，離心10min。

1.3.4 棄去上清，剪刀剪去吸管頭，輕輕倒出細(xì)胞塊于濾紙中，包裹后放入已編號(hào)組織包埋盒，與活體病理檢查組織同放于全自動(dòng)病理組織脫水機(jī)中，進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3.5 常規(guī)包埋、切片、HE染色、診斷。根據(jù)診斷需要，進(jìn)行特殊染色、免疫組化、分子病理等檢測(cè)。

2.結(jié)果

細(xì)胞塊完整，不易破碎，可多次重復(fù)切片；HE染色鏡下細(xì)胞富集，有效成分多，核漿分明；免疫組化染色結(jié)果定位準(zhǔn)確，易于判讀；可進(jìn)行FISH、PCR、重排、測(cè)序等分子病理檢測(cè)。

3.討論與體會(huì)

3.1 操作要點(diǎn)

純雞蛋清太過(guò)粘稠，不易吸取，且離心后容易與沉淀物分層；本科室采用甘油，按照蛋清、甘油7:3的比例混勻制成蛋白甘油使用，稀釋度合理，離心后細(xì)胞團(tuán)塊堅(jiān)實(shí)，不易散。

該方法的原理是95%酒精使蛋白變性凝固作為基質(zhì)對(duì)分散的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行包裹，胸膜腔積液等含蛋白較多的體液標(biāo)本，初次離心后可留1ml上清液不必傾去，加入95%酒精可使蛋白析出，再次離心后形成自體蛋白基質(zhì)；如細(xì)胞團(tuán)小則同時(shí)加入蛋白甘油作為基質(zhì)。尿液、腦脊液、細(xì)胞穿刺液等細(xì)胞量較少，應(yīng)加入蛋白甘油作為基質(zhì)，才能制作出較完整的細(xì)胞塊。

為了使蛋白質(zhì)充分變性形成蛋白基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞，在標(biāo)本中加入95%酒精和蛋白甘油后，必須用吸管反復(fù)吹打混勻。

血性標(biāo)本液，需在初次離心沉淀后，加入細(xì)胞清潔液，充分震蕩后再次離心，去除紅細(xì)胞后再按照上述方法制作細(xì)胞塊。

3.2 技術(shù)缺陷

對(duì)于漿膜腔積液，特別是臨床懷疑惡性腫瘤患者的漿膜腔積液，陽(yáng)性檢出率高，效果顯著；但是對(duì)于尿液、腦脊液等細(xì)胞較少的體液標(biāo)本，做出的細(xì)胞塊有效成分較少，僅作為輔助運(yùn)用；

部分細(xì)胞塊進(jìn)行免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)背景較深，估計(jì)與自體蛋白有關(guān)，后續(xù)將進(jìn)行相關(guān)工作的研究。

3.3 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

細(xì)胞學(xué)病理檢查，是通過(guò)有創(chuàng)或微創(chuàng)的方法，采集人體可疑病變部位的細(xì)胞及組織碎片，經(jīng)病理細(xì)胞學(xué)技術(shù)員制片，病理醫(yī)師顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行疾病診斷的病理學(xué)方法之一。與活體組織檢查相比，具有創(chuàng)傷小、標(biāo)本易獲得、報(bào)告時(shí)限短等優(yōu)點(diǎn)。但在診斷陽(yáng)性率、準(zhǔn)確性方面，與活體組織檢查有一定差距，以及無(wú)法進(jìn)行特殊染色、免疫組化、分子病理等進(jìn)一步檢測(cè)與診斷，限制了病理細(xì)胞學(xué)的發(fā)展。我科開(kāi)展的蛋白甘油凝集法細(xì)胞塊制作技術(shù)，將有可疑病變的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制作成細(xì)胞塊，固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后，作出的蠟塊具有能多次切片、易于長(zhǎng)期保存，可進(jìn)行特殊染色、免疫組化和分子病理診斷等優(yōu)點(diǎn)，提高細(xì)胞學(xué)診斷的陽(yáng)性率，是對(duì)細(xì)胞學(xué)診斷有力的補(bǔ)充和擴(kuò)展。

對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道的瓊脂包埋法、固定沉淀法、血漿凝血酶沉淀法、雞蛋清凝集法等[1-4]。瓊脂包埋法較復(fù)雜，瓊脂不易得且需要加熱溶解，其對(duì)脫水影響也很大，現(xiàn)已很少使用；血漿凝固酶難以采購(gòu)；固定沉淀法作出的細(xì)胞塊易碎不堅(jiān)固，對(duì)于細(xì)胞很少的體液難以成功，縮小的細(xì)胞塊可用范圍。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)，95%酒精固定蛋白甘油凝集法成功率高適用于所有送檢體液標(biāo)本、且操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定興高，材料易得，成本低廉，得到的細(xì)胞塊較堅(jiān)實(shí)完整、脫水處理佳，HE染色紅藍(lán)對(duì)比分明、免疫組化染色結(jié)果清楚。

本科室從2013年至今用此方法制作了細(xì)胞塊4000余例，免疫組化染色1300余例，證實(shí)該方法切實(shí)可行，可在各級(jí)醫(yī)院病理科開(kāi)展。