中國境內(nèi)印度塊菌的分布及研究概況

陳正啟，余金鳳，湯昕明，郭 相，羅 瑞，吳素蕊

（中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

印度塊菌（Tuber indicumCooke et Massee）是一種具有重要經(jīng)濟和生態(tài)價值的子囊菌門地下生的外生菌根真菌，主要產(chǎn)自中國西南地區(qū)，是中國出口的主要塊菌種類。印度塊菌隸屬于真菌界（Fungi）、子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、塊菌科（Tuberaceae）[1]，是中國目前產(chǎn)量最大且分布最廣的塊菌種類，已成為中國西南地區(qū)最主要的貿(mào)易野生食用菌種類[2-3]。

印度塊菌子囊果地下生，球形或橢圓形，幼時暗紅色、紫紅褐色，成熟后漸變成紫褐色、黑褐色或褐黑色；表面具明顯的多角形瘤突。包被厚250～950 μm（包括瘤突），2層，外層由近球形、橢圓形或少部分長柱形細胞組成的擬薄壁組織構(gòu)成，最外2層細胞紅褐色或黑紅褐色，向內(nèi)漸變?yōu)辄S褐色；內(nèi)層由淡黃褐色至無色的薄壁交織菌絲組成，少數(shù)膨大的淡黃褐色菌絲混于近產(chǎn)孢組織處的包被內(nèi)層中。產(chǎn)孢組織由無色薄壁的交織菌絲組成，幼時白色或灰白色，隨著成熟度的不同逐漸變?yōu)辄S褐色、褐色、黑褐色或黑色，具有白色、分枝、迷路狀分布的菌脈。子囊球形、橢圓形或不規(guī)則，無色，無柄或幼時偶見有柄，壁薄或稍厚，內(nèi)含1～6個孢子。子囊孢子多為橢圓形，少數(shù)寬橢圓形；幼時無色，隨成熟度逐漸變成黃褐色、紅褐色、黑褐色或黑色；孢子表面以離散的刺為主，部分孢子表面刺基部加寬而使得基部連接形成很低的脊和完整或不完整的網(wǎng)紋，刺的頂端為游離狀、頂鈍或稍尖、部分有彎鉤，其疏密在子囊果個體間存在較大差異[3-5]。

1 印度塊菌的首發(fā)和定名

印度塊菌是Cook和Massee于1892年根據(jù)在印度喜馬拉雅西南坡山麓小鎮(zhèn)慕沙瑞（Mussoorie）附近山地（海拔約2 000 m）采到的塊菌標本作為模式描述的一個新種[3,6]。此后近百年間亞洲塊菌屬研究基本沒有進展，針對印度塊菌的研究亦是如此。

臧穆等[7]1988年在云南省東南部的松、櫟林下曾發(fā)現(xiàn)了幾個不成熟的塊菌，但沒有確認種名；1990年在滇西北和滇東北又相繼在麻櫟（Quercus acutissimaCarrruth.）、黃背櫟（Quercus PannosaHand.-Mazz）、矮高山櫟（Quercus monimotricha）、云南松（Pinus yunnanensis）、華山松（Pinus armandiiFranch）以及地石榴（Ficus tikouaBur.）等植物的根系離土表4～11 cm處發(fā)現(xiàn)并采集到同種塊菌，經(jīng)核實是印度塊菌，這是中國境內(nèi)最早確認有印度塊菌的記錄。

2 印度塊菌在中國境內(nèi)的分布

野生印度塊菌主要發(fā)生在松屬純針葉林、松—櫟混交林以及櫟類闊葉林中，其中以松—櫟混交林分布居多。發(fā)生地喬木和灌木層一般較為稀少，草本層比較豐富，這里所說的草本層指在印度塊菌發(fā)生地四周的環(huán)境。清源等[8]在2015年的研究中指出：適宜印度塊菌生長的位置多在中坡和中下坡，坡位越高越不適宜。

目前的研究顯示中國的印度塊菌分布于云南省的昆明、楚雄、貢山、保山、玉溪、麗江、會澤、昭通、邱北、云臺山以及四川省涼山州的會東、攀枝花市、西昌市[4,9-11]。另外，據(jù)臧穆等[12-14]的報道，除四川和云南之外，西藏也有該種的分布，并進一步指出該種分布在橫斷山區(qū)和喜馬拉雅山系，但在文中沒有說明詳細的分布地點；據(jù)清源[8]的文章報道，其在西藏的林芝縣采集到了印度塊菌的樣品。

3 分子系統(tǒng)學(xué)及遺傳多樣性研究

近年來，印度塊菌分子系統(tǒng)學(xué)和遺傳多樣性研究取得了一些重要進展，目前的研究認為印度塊菌是一個復(fù)合群，該復(fù)合群主要是指印度塊菌、中華塊菌（Tuber sinenseK. Tao and B. Liu）、喜馬拉雅塊菌（Tuber himalayenseB.C. Zhang and Minter）、臺灣塊菌（Tuber formosanumH.T. Hu and Y. Wang）等一大類形態(tài)相似且主要分布在印度及中國西南地區(qū)的塊菌屬成員[ 15-17 ]。

Lanfranco等[18]最早將分子生物學(xué)方法運用到塊菌屬研究，利用RAPD分子標記區(qū)分了6個相似種。此后發(fā)展出利用ITS、β-tubulin等多種單一分子標記來進行系統(tǒng)發(fā)育分析，解決種間近源關(guān)系問題[19]。Paolocci等[20]利用RFLP-ITS的分析指出中國黑塊菌與歐洲黑孢塊菌是2個不同的分支，且中國的印度塊菌復(fù)合群分成2個大分支。隨后不久，Roux等[21]將這2支分別鑒定為Tuber himalayense和Tuber indicum，這個觀點被Zhang等[22]接受。Mabru等[23]認為來自中國的黑塊菌包括Tuberhimalayense和Tuberindicum在內(nèi)都可能是Tuberindicum的不同表現(xiàn)形式。Wang等[24]根據(jù)ITS、β-tubulin序列片段的聯(lián)合分析，認同Mabru等人的觀點，認為中華塊菌、喜馬拉雅塊菌、假喜馬拉雅塊菌都是印度塊菌的異名。Chen等[25]基于形態(tài)和幾個分子片段序列的綜合分析，認為中華塊菌應(yīng)是印度塊菌的異名，印度塊菌復(fù)合群至少包含2個隱形種。喬鵬[26]認為臺灣塊菌雖然與印度塊菌親緣關(guān)系較近，但基于它們的形態(tài)特征、共生樹種、地理分布及分子系統(tǒng)發(fā)育分析來看，臺灣塊菌應(yīng)是一個獨立種；此外，通過ITS序列和SSR分子標記分析印度塊菌復(fù)合群的結(jié)果說明，中國西南地區(qū)印度塊菌復(fù)合群存在具有顯著遺傳分化的2個譜系，它們可能是印度塊菌和喜馬拉雅塊菌[26-27]。

印度塊菌復(fù)合群的交配型基因的分離，說明其有性繁殖是異宗配合，復(fù)合群內(nèi)不同個體交配型基因的序列比對研究說明該復(fù)合群存在隱性種[27-28]。最新的關(guān)于印度塊菌復(fù)合群遺傳多樣性的研究提出，該復(fù)合群內(nèi)有較高的遺傳多樣性，中國西南地區(qū)印度塊菌復(fù)合群的2個明顯譜系是喜馬拉雅塊菌和印度塊菌[25,29]，這與先前的研究結(jié)果基本一致。此外，已有研究人員利用印度塊菌的交配型基因作為分子標記用于人工栽培方面的研究[30]。

4 印度塊菌的生物化學(xué)研究

由于印度塊菌的商業(yè)價值和獨特吸引力，許多科研人員對其進行營養(yǎng)價值、活性成分和功效等方面的研究。早在1990年，陶愷等[31]便對現(xiàn)在認為是印度塊菌異名的中華塊菌進行了營養(yǎng)成分和含量的分析，結(jié)果表明除礦質(zhì)元素外，中華塊菌可與黑孢塊菌相媲美。

目前，關(guān)于印度塊菌生物化學(xué)方面的研究熱點集中在其活性成分和功效上，印度塊菌的主要活性成分有神經(jīng)酰胺、a-雄烷醇、多糖等。神經(jīng)酰胺作為一種天然的鞘脂類化合物，主要是由長鏈脂肪酸和鞘氨醇堿性骨架結(jié)構(gòu)通過酰胺鍵相連形成的一系列化合物[32-33]。Gao等[34-35]首次在印度塊菌活性成分中分離到4個新的神經(jīng)酰胺類化合物，吳少華等[36]從印度塊菌的95%乙醇提取液中分離得到麥角甾醇類衍生物、植物鞘氨醇型鞘脂等化學(xué)成分，其中分離出的2種植物鞘氨醇型鞘脂類化合物具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用。關(guān)于神經(jīng)酰胺生理功能方面的文獻報道也有不少。Fillet等[37]研究表明，神經(jīng)酰胺在細胞的生長和凋亡過程中起著重要的第二信使的作用，同時對維持細胞的滲透壓和膜蛋白的穩(wěn)定性也起著不可忽視的作用。金朝輝等[38]研究表明，神經(jīng)酰胺不僅有誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，在不同的細胞不同的條件下又可抑制細胞凋亡，這對認識細胞的生長發(fā)育和老化、惡性腫瘤的治療等均有重大意義。Pu等[39]對神經(jīng)酰胺的功能和應(yīng)用進行了較系統(tǒng)的歸納，指出神經(jīng)酰胺具有保濕（可以作為皮膚屏障）、抗腫瘤、誘導(dǎo)細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫等功能。

a-雄烷醇是塊菌中存在的一種具有生物活性的類固醇化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于人體內(nèi)的性激素成分，且香味濃厚，具有成為新型性激素類藥物的潛力[40-41]。由于a-雄烷醇在哺乳類動物性行為方面的藥用價值，國內(nèi)外研究人員對該化合物進行了化學(xué)合成和液體發(fā)酵方面的研究?；瘜W(xué)合成存在著反應(yīng)步驟過多、不利于實際生產(chǎn)、副產(chǎn)物較多、不環(huán)保等問題。Wang等[42]用液體發(fā)酵法生產(chǎn)a-雄烷醇，結(jié)果表明：發(fā)酵液中a-雄烷醇最高含量可達123.5 ng/mL，可以滿足實際生產(chǎn)需求。

塊菌多糖是Hu等[43]1994年首次從印度塊菌子實體中提取到的一種蛋白多糖。曹晉忠等[44]關(guān)于印度塊菌粗多糖抗氧化活性研究的結(jié)果顯示，印度塊菌水溶性多糖具有良好的抗氧化活性，對人體的氧化損傷有一定的保護作用。羅強等[45]對印度塊菌水溶性粗多糖進行提取分離純化，得到了其主要多糖組分TIP-A，并證實TIP-A對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基有較強的清除能力；此外，TIP-A還對過氧化氫誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡有很好的抑制作用。大量的研究顯示，塊菌多糖作為一種真菌多糖，水溶性好、抑制腫瘤作用明顯，有開發(fā)成抗腫瘤免疫療法藥物的潛力。

此外，郭坦等[46]對印度塊菌3種提取物（55%乙醇、石油醚、乙酸乙酯）清除DPPH、羥基自由基能力和鐵離子螯合能力等進行了測定，結(jié)果表明：印度塊菌這3種提取物不僅有較強的清除自由基能力，還有很好的鐵離子螯合活性，說明這3種提取物擁有較強的抗氧化活性。

關(guān)于印度塊菌生物化學(xué)方面的研究除顯示其含有豐富的營養(yǎng)成分外，印度塊菌中的一些活性成分的提取及功能研究也讓人們對印度塊菌有了更深入的了解，如關(guān)于印度塊菌多糖的研究顯示其具有開發(fā)成綠色抗氧化劑的潛力，更多有關(guān)這些活性成分的研究還有待進行。

5 印度塊菌的生活史

印度塊菌的生活史可簡單地分為3個階段，分別是子囊孢子萌發(fā)形成菌絲、菌絲生長并與宿主植物形成菌根、形成子囊果[19,27]；其中子囊果的生成是印度塊菌生活史中一個特殊的階段，目前關(guān)于這一階段的機制尚不清楚。

印度塊菌生活史中的許多謎團尚未解開，原因是缺少孢子萌發(fā)的系統(tǒng)試驗，導(dǎo)致不能利用菌絲交配進行繁殖試驗[47-48]。2013年，研究人員在印度塊菌中分離和鑒定到了交配型基因，并比對印度塊菌和黑孢塊菌的交配型基因結(jié)構(gòu)，認為這2個相近的種間存在雜交的可能[29]。相信印度塊菌子實體的形成和發(fā)育機制的研究，將會隨著其交配型基因的成功分離和鑒定得到巨大的推動。如關(guān)于黑孢塊菌的研究顯示，通常只有1種交配型基因存在于人工種植園內(nèi)同一宿主樹木菌根、塊菌子實體產(chǎn)孢組織及根部土壤的菌絲這三者中，據(jù)此猜測不同交配型基因的菌株在宿主樹種根部的定殖要通過競爭，而這種競爭反過來會限制菌株在土壤中的分布[27]。有人根據(jù)關(guān)于黑孢塊菌的研究結(jié)果推測，在塊菌子實體形成過程中，不同菌株可能共享“母本”（外生菌根中的菌絲），“父本”則是隨機的[27,49]。這些研究結(jié)果也為印度塊菌生活史的研究提供了具體思路，但要徹底弄清楚印度塊菌的生活史機制，還需要深入的研究。塊菌這種復(fù)雜的有性生殖過程剛好從側(cè)面說明了塊菌從菌根形成到產(chǎn)出子實體需要幾年時間是有原因的[27,50]。隨著黑孢塊菌生活史研究進展的不斷推進，相信在眾多菌物工作者的努力下印度塊菌生活史謎底揭開的日子將會很快到來。

6 印度塊菌的人工栽培研究

法國和意大利的菌物工作者早在18世紀就開始了塊菌的人工栽培研究，當時的做法是將小樹苗種植在產(chǎn)塊菌的林地，靠地下塊菌的菌絲自然感染樹苗來培育菌根化樹苗[51]。在19世紀70年代，研究人員利用塊菌子囊孢子生產(chǎn)菌根化樹苗，具體做法有2種：一種是將塊菌子囊孢子液與無菌培養(yǎng)基質(zhì)混合，再在培養(yǎng)基質(zhì)上移栽共生樹苗來獲得菌根化樹苗；另一種是在栽培共生樹苗的培養(yǎng)基質(zhì)中注入塊菌孢子液，培養(yǎng)菌根化樹苗[52]。采用這種技術(shù)生產(chǎn)的菌根化樹苗在1978年初次獲得了黑孢塊菌子實體，現(xiàn)已被普遍應(yīng)用到多種塊菌的人工栽培研究中[53]。歐洲有很長的人工栽培塊菌歷史，利用塊菌子囊孢子接種共生樹苗合成菌根化樹苗，再移植建立人工塊菌種植園的栽培方法已有近50年的歷史[6,54-55]。

中國的塊菌特別是印度塊菌的人工栽培研究才剛剛起步。貴州省林業(yè)科學(xué)研究院胡炳福等[56]在2002年利用昆明食用菌研究所提供的印度塊菌子實體制作孢子懸浮液，分別接種馬尾松、云南松等7種無菌幼苗，隨后將菌根化的樹苗移栽造林，并于2008年12月在試驗地調(diào)查發(fā)現(xiàn)436株幼樹中有35株的根部土壤中已長出印度塊菌子實體。此外，中科院昆明植物研究所研究組在印度塊菌的人工栽培方面做了一些首創(chuàng)性的研究工作，在國內(nèi)最先使用獨創(chuàng)的技術(shù)培育出了印度塊菌與云南松、華山松、板栗等菌根化樹苗，同時建立了種植示范試驗基地，并于2012年12月在昆明市團結(jié)鄉(xiāng)種植基地初次采集到了由人工栽培的菌根化樹苗培育出的印度塊菌子實體，為中國印度塊菌人工種植園乃至其他可食塊菌的種植園建設(shè)指引了方向[17,57]。

雖然中國的塊菌研究特別是人工種植還處于起步階段，但可喜的是云南和貴州等地都先后建立了印度塊菌種植試驗基地。中國西南地區(qū)適宜印度塊菌生長的地域面積廣，適宜感染形成印度塊菌菌根化的樹種也豐富多樣，同時還是印度塊菌的原產(chǎn)地，種植潛力和前景非常巨大。印度塊菌種植園的成功建立和產(chǎn)出會給西南地區(qū)荒漠化的治理提供一個新的思路，同時帶動山區(qū)經(jīng)濟的發(fā)展。

7 討論與展望

隨著關(guān)于印度塊菌研究的深入，不斷有新的結(jié)果報道出來，如Fu等[58]在2016年的研究中指出，在產(chǎn)生印度塊菌的土壤中，鞘氨醇單胞菌屬細菌、球囊霉屬真菌、絲足蟲類及褐藻門類非真菌生物的生物量遠遠大于其他生物，但是它們在印度塊菌生長過程中扮演的角色還不明確。Li等[59]在2017年的研究結(jié)果表明印度塊菌會影響共生樹木（華山松）菌根周圍土壤中細菌的多樣性。越來越多的研究人員開始關(guān)注印度塊菌根際土壤生物多樣性，這也許為印度塊菌生活史及人工栽培的研究提供了一個新的方向。

在塊菌屬研究方面，綜合國內(nèi)外研究歷史和現(xiàn)狀，物種鑒定、遺傳多樣性分析、系統(tǒng)演化及人工栽培在很長的一段時間內(nèi)仍將是塊菌屬研究的熱點方向。具體到印度塊菌方面，筆者認為有一些問題尤其值得關(guān)注，主要是以下幾個方面：

印度塊菌的人工栽培已經(jīng)成功，但要實現(xiàn)大規(guī)模推廣仍有很長的一段路要走。目前基本用野生印度塊菌子囊孢子生產(chǎn)菌根化樹苗，從長遠發(fā)展來看，肯定無法滿足規(guī)?；N植生產(chǎn)的需求，應(yīng)加大印度塊菌純種分離培養(yǎng)工作的強度，以期早日獲得人工培育的菌種，為人工栽培研究提供菌種支撐。

西南地區(qū)有豐富的印度塊菌資源，但隨著民眾意識到印度塊菌的巨大經(jīng)濟價值，濫采濫挖的現(xiàn)象越來越嚴重，生態(tài)破壞也隨之加劇，印度塊菌產(chǎn)量逐年下降，如不采取措施，這將形成一個惡性循環(huán)。另外，應(yīng)加強在西南地區(qū)的資源研究，特別是印度塊菌群體遺傳多樣性的研究，充分了解其群體遺傳特征，構(gòu)建西南地區(qū)印度塊菌群體遺傳多樣性資源圖譜，更系統(tǒng)全面地摸清印度塊菌資源分布及生態(tài)多樣性，為印度塊菌的資源保護提供科學(xué)依據(jù)。同時標注其分布量少且遺傳多樣性低的產(chǎn)地，建立符合當?shù)厍樾蔚谋Ｗo機制，避免無節(jié)制的濫采濫挖致使當?shù)赜《葔K菌資源瀕臨滅絕的情況出現(xiàn)。此外，科普宣傳對資源保護的作用不可估量，建議科研機構(gòu)和林業(yè)及主管食用菌的政府部門聯(lián)合起來，通過長期持久的科普教育工作來提高產(chǎn)區(qū)人民科學(xué)采集和保護資源的意識。

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