皮膚微生物多樣性與相關(guān)疾病研究進(jìn)展

翟婉芳 唐先發(fā) 楊 森

皮膚是機(jī)體與外界環(huán)境間的重要屏障，既可以防止水分流失和病原體侵入，也寄生著復(fù)雜多樣的微生物群落，包括細(xì)菌、古生菌、真菌、病毒及螨蟲類。以往我們對機(jī)體各部位微生物群的認(rèn)識基于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，根據(jù)菌株表型特征進(jìn)行分類鑒定，已從正常皮膚分離培養(yǎng)出葡萄球菌屬、微球菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、丙酸桿菌屬和不動桿菌屬[1],但因?qū)嶒炇也荒芡耆佻F(xiàn)微生物的自然生存條件，以及優(yōu)勢菌種抑制小種群生長，使得傳統(tǒng)培養(yǎng)法在微生物多樣性認(rèn)識上受到局限[2]。近些年隨著高通量DNA測序技術(shù)逐漸成熟，以及有助于序列識別的數(shù)據(jù)庫擴(kuò)增，不僅證實了已知微生物物種，更鑒定了新物種，增加了對機(jī)體各部位微生物群多樣性的認(rèn)識[3]。而對皮膚微生物的深入研究為將來認(rèn)識微生物與宿主、環(huán)境以及微生物群落間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。該文針對近些年利用現(xiàn)代測序技術(shù)鑒定健康人及疾病相關(guān)的微生物多樣性(尤其是細(xì)菌)的研究進(jìn)展作一簡要綜述。

1 皮膚微生物的現(xiàn)代測序技術(shù)

皮膚微生物樣本的采集方式包括無菌棉簽擦拭[1,4-6]、無菌刀刮屑[6,7]和活組織檢查[6,8]這三種采集法獲得的微生物群落結(jié)果無明顯差異[6]，拭子法因快速簡便、侵襲性小廣泛應(yīng)用，而只在研究皮膚深層環(huán)境微生物時才考慮活組織檢查[9]。樣本采集后常于-20℃、-80℃或液氮中冷凍儲存留待DNA提取[10]。大多數(shù)DNA提取過程經(jīng)歷細(xì)胞裂解、去除非DNA大分子和收集DNA，為充分裂解細(xì)胞常聯(lián)合運用化學(xué)、物理和機(jī)械法，商業(yè)的DNA提取試劑盒(如Qiagen DNeasy DNA Extraction kit, MOBIO Power Soil DNA Isolation kit )也被廣泛應(yīng)用[9]。

DNA成功提取后的關(guān)鍵步驟是根據(jù)鑒定的微生物類別選擇靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物測序分析。鑒定細(xì)菌及古生菌時選取的靶基因為16SrDNA[1,4,8,11]，系編碼原核生物核糖體小亞基的基因，包括保守區(qū)及高變區(qū)，保守區(qū)用于設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，高變區(qū)用于系統(tǒng)發(fā)育分類，鑒定真菌時選取的靶基因可為18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)基因[5,7,11]，病毒因缺乏保守區(qū)難以形成擴(kuò)增子，通常采用全基因組鳥槍測序法，即給定樣品的DNA隨機(jī)打斷成小的片段，分別測序形成短序列，再基于重疊關(guān)系拼接成一條一致序列。目前應(yīng)用的測序技術(shù)有一代的Sanger測序(如Applied Biosystems 3730xlDNA分析儀)和高通量焦磷酸測序(如Roche 454 Genome Sequencer GS,FLX,FLX Titanium)、Illumina微陣列(如Illumina Solexa,HiSeq2000,MiSeq)。測序完成后需對數(shù)百萬的序列進(jìn)行生物信息分析，常用的生信分析管道有QIIME,mothur,MetaPhlAn，以及可視化軟件包如MEGAN，Krona，MGAviewer和MetaSee，從而進(jìn)行序列歸類和操作分類單元(OTU)劃分、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、生境內(nèi)物種多樣性(α多樣性)和生境間物種多樣性(β多樣性)評估[9,10]。但因真菌和病毒的基因序列數(shù)據(jù)庫和分析軟件工具有限，對其研究還有待于進(jìn)一步發(fā)展。

2 健康人皮膚微生物

2.1 細(xì)菌 根據(jù)皮膚生理特性不同，將其分為濕性(腋窩、肘窩、腘窩、腹股溝等)、干性(掌前臂、小魚際等)及油脂區(qū)域(眉間、后背、外耳道等)，使用16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育對居住在不同皮膚生境的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，揭示了宿主棲息地對細(xì)菌群落的形成有決定性作用。細(xì)菌在門水平上無區(qū)域差異，分為四種優(yōu)勢菌，即放線菌門、厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，而在種水平上存在顯著差異，油脂區(qū)域以丙酸桿菌種和葡萄球菌種分布為主，濕性區(qū)域優(yōu)勢菌為棒狀桿菌種，其次為葡萄球菌種，而干性區(qū)域有更大的細(xì)菌多樣性，β-變形菌和黃桿菌是其中的一部分[4]。對油脂及干性區(qū)域接種外來菌，觀察2 h,4 h,8 h后局部菌群變化，發(fā)現(xiàn)油脂區(qū)域可通過促進(jìn)原生菌繁殖，抑制外來微生物的生長維持局部微生態(tài)屏障的穩(wěn)定，有更穩(wěn)定的細(xì)菌群落構(gòu)成[12]。

其他宿主因素也參與皮膚菌群形成，如年齡、性別、種族等。胎兒皮膚是無菌的，于分娩過程中出現(xiàn)微生物定植，經(jīng)陰道分娩的新生兒皮膚細(xì)菌群落與母親的陰道微生物相似，主要是乳桿菌屬、普雷沃菌屬或纖毛菌屬，而剖腹產(chǎn)的新生兒皮膚菌群類似于成人皮膚微生物，以葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬和丙酸桿菌屬為主[13]。出生后皮膚結(jié)構(gòu)及功能逐漸成熟，皮膚細(xì)菌群落于嬰兒期形成發(fā)展，隨著年齡增加低優(yōu)勢菌屬豐度增加，而占優(yōu)勢的葡萄球菌屬和鏈球菌屬豐度降低，呈現(xiàn)更大的菌群多樣性，并表現(xiàn)出類似于成人的區(qū)域分布特征[14]。成年人的皮膚菌群多樣性顯著高于青少年和老年人，同時菌群結(jié)構(gòu)即不同分類群的相對豐度也存在年齡差異，如老年人的棒狀桿菌屬、水棲菌屬豐度較高，而丙酸桿菌屬、葡萄球菌屬豐度較低。定植菌的年齡差異可能與皮膚營養(yǎng)和屏障功能的改變相關(guān)，如老化皮膚的結(jié)締組織和外周血管萎縮，皮脂腺和汗腺分泌減少[15,16]。

女性表現(xiàn)出更高的菌群多樣性，同時在菌群結(jié)構(gòu)上也有性別差異，如丙酸桿菌屬、棒狀桿菌屬的相對豐度男性高于女性，不動桿菌屬、副球菌屬、鞘脂單胞菌屬的相對豐度女性高于男性。皮膚菌群的性別差異或許可以用男性和女性皮膚生理環(huán)境如激素代謝、排汗率、油脂分泌和酸堿度的差異解釋[16]。

研究發(fā)現(xiàn)皮膚菌群的種族變化可能與某些低豐度分類單元(OTUs)的存在或缺失相關(guān)，同一皮膚部位低豐度OTUs的存在或缺失在種族間表現(xiàn)出顯著差異，甚至高于其在種族內(nèi)不同皮膚部位間的差異，而皮膚部位中豐度最高的菌群不存在種族差異。未來對低豐度OTUs的時間動態(tài)研究或許可以了解其在皮膚中扮演的角色，即暫駐菌還是常駐菌[17]。

除了宿主內(nèi)在因素，宿主暴露的外環(huán)境也參與皮膚微生物的形成，對城市和農(nóng)村居民皮膚菌群的研究發(fā)現(xiàn)兩者的細(xì)菌豐度不同，其中特布爾西氏菌屬在城市居民中有更高的相對豐度，而農(nóng)村居民的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性顯著高于城市居民。從事戶內(nèi)工作的城市居民皮膚微生物主要是人源性的，而從事戶外工作的農(nóng)村居民皮膚微生物可能受土壤、水棲和宿主相關(guān)微生物的影響[16]。

2.2 其他微生物 大多數(shù)微生物研究關(guān)注于皮膚細(xì)菌群落構(gòu)成，但存在于皮膚棲息地的微生物不限于細(xì)菌。已經(jīng)培養(yǎng)出的皮膚共生真菌有馬拉色菌屬、紅酵母屬、德巴利酵母屬、隱球菌屬和假絲酵母屬。現(xiàn)代測序技術(shù)了解到皮膚真菌群分布同樣具有區(qū)域差異性，軀體近心端及手臂的優(yōu)勢真菌為馬拉色菌屬，其中外耳道、耳后皺襞及眉間以限制性馬拉色菌為主，后背、枕部和腹股溝以球形馬拉色菌為主，而鼻孔、肘窩、掌前臂和小魚際表現(xiàn)為限制性馬拉色菌、球形馬拉色菌和合軸馬拉色菌共存，足底則呈現(xiàn)出復(fù)雜的菌群多樣性，除馬拉色菌屬外，還包括曲霉屬、隱球菌屬、紅酵母屬、附球菌屬。而健康人皮膚表面也檢測到致病真菌，如季也蒙畢赤酵母、阿氏絲孢酵母、互隔交鏈孢霉和出芽短梗霉[7，11,18]。

病毒常被視作病原體，但DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)健康人皮膚表面定植著復(fù)雜的病毒群，有乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科和圓環(huán)病毒科，乳頭瘤病毒科以β和γ乳頭瘤病毒為主，多瘤病毒科主要是默克爾細(xì)胞多瘤病毒、人多瘤病毒[6，7，9]，而圓環(huán)病毒科主要是圓環(huán)病毒NG12[19]。

3 皮膚疾病與微生物

3.1 特應(yīng)性皮炎 特應(yīng)性皮炎患者皮損區(qū)及周圍正常皮膚均可培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌，通過分泌一些毒性物質(zhì)，如超抗原SAgs、α溶血素、δ毒素等增加疾病的嚴(yán)重程度[20]，而金黃色葡萄球菌的易感性可能與皮膚物理屏障失調(diào)及抑制微生物生長的皮膚天然免疫防御系統(tǒng)缺陷相關(guān)。炎癥刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后產(chǎn)生抗微生物肽HBD-2、LL-37，是皮膚天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，對特應(yīng)性皮炎皮損區(qū)組織病理進(jìn)行免疫組化和實時定量PCR均證明了這種抗微生物肽的表達(dá)缺陷[21]。利用DNA測序技術(shù)對疾病穩(wěn)定期、發(fā)作期和治療后的皮損區(qū)進(jìn)行皮膚細(xì)菌群鑒定，與穩(wěn)定期和治療后相比，發(fā)作期菌群多樣性降低，鏈球菌屬、丙酸桿菌屬和棒狀桿菌屬減少，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌增加，除外還檢測到低豐度屬如羅氏菌屬在三種疾病狀態(tài)中增多[22]。這些研究可以解釋臨床上局部或系統(tǒng)性應(yīng)用抗生素及稀釋漂白浴治療特應(yīng)性皮炎，目的是減少微生物負(fù)荷[23]。

而對輕中重度的特應(yīng)性皮炎患者皮損區(qū)進(jìn)行真菌群研究，發(fā)現(xiàn)皮損區(qū)存在馬拉色菌微生物群、非馬拉色菌的酵母菌群及絲狀真菌微生物群。馬拉色菌群以限制性馬拉色菌和球形馬拉色菌為主，與正常皮膚無異，但疾病嚴(yán)重程度不同兩者比例不同，輕中度者以限制性馬拉色菌更占優(yōu)勢，重度患者兩者比例相當(dāng)。與正常皮膚相比，皮損區(qū)的非馬拉色菌酵母菌群顯示出更大的物種多樣性，白色念珠菌、異常威克漢姆酵母、液化隱球菌和阿氏絲孢酵母的檢出率更高，而絲狀真菌群中的枝孢菌和Toxicocladosporium irritans僅在特應(yīng)性皮炎皮損區(qū)中檢測到[7]。此外，還發(fā)現(xiàn)特應(yīng)性皮炎患者有更高的播散性病毒感染風(fēng)險，如傳染性軟疣病毒、牛痘病毒、單純皰疹病毒等[24]。

3.2 銀屑病 銀屑病是一種慢性紅斑鱗屑性皮膚病，培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損區(qū)及鼻孔中的金黃色葡萄球菌及產(chǎn)毒菌株增加[25]。利用DNA測序技術(shù)對銀屑病患者皮損區(qū)采取無菌棉簽擦拭或組織病理的方式進(jìn)行細(xì)菌種群鑒定，均顯示銀屑病與細(xì)菌群落構(gòu)成及優(yōu)勢菌的改變相關(guān)，皮損區(qū)在門水平上的優(yōu)勢菌為厚壁菌門、放線菌門和變形菌門，其中厚壁菌門較正常皮膚增多，放線菌門較正常皮膚減少，不同的是拭子法得出變形菌門較正常皮膚減少，而組織病理相反，因為組織病理包括真表皮，拭子法僅是對皮膚表面的研究，兩種采樣方法造成的結(jié)果差異可能與存在于真表皮細(xì)胞、皮脂腺單位中的細(xì)菌相關(guān)。屬水平上皮損區(qū)丙酸桿菌屬降低，鏈球菌屬與丙酸桿菌屬的比例顯著升高，種水平上皮損區(qū)痤瘡丙酸桿菌顯著減少，且物種豐度和均度下降[8,26]。一項對泰國銀屑病患者皮膚微生物的研究發(fā)現(xiàn)僅從銀屑病患者皮膚拭子中分離培養(yǎng)出鏈球菌[27]，盡管銀屑病的治療指南不再推薦鏈球菌干預(yù)治療，但抗生素仍是斑塊型銀屑病急性發(fā)作的良好治療手段，這是因為流行病學(xué)和體外研究實驗均支持銀屑病發(fā)作和咽部鏈球菌感染相關(guān)[28]。除了細(xì)菌改變，銀屑病患者血清中尚存在糠秕馬拉色菌誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌的Th1細(xì)胞因子，皮損區(qū)與健康皮膚均以馬拉色菌屬為優(yōu)勢真菌，但皮損區(qū)馬拉色菌屬具有較低的總體豐度，真菌群呈現(xiàn)更大的多樣性[5,29]。

3.3 酒渣鼻 酒渣鼻是一種慢性炎性皮膚病，特征性表現(xiàn)為面部毛細(xì)血管擴(kuò)張性紅斑、炎癥性丘疹和膿皰的組合。研究表明，患者面部皮損區(qū)有高密度的毛囊蠕形螨定植[30,31]，其致病機(jī)制包括激活免疫應(yīng)答、反應(yīng)性過度角化阻塞毛囊、異物肉芽腫形成和作為細(xì)菌載體[32]?，F(xiàn)代測序技術(shù)對紅斑毛細(xì)血管擴(kuò)張型(ETR)和丘疹膿皰型(PPR)酒渣鼻患者蠕形螨相關(guān)的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，與正常皮膚及ETR相比，PPR患者皮損區(qū)放線菌門比例下降，而變形菌門和厚壁菌門比例升高，屬水平上ETR及PPR的代表菌分別為嗜血桿菌屬和埃希氏菌屬，種水平上分別為Duganella zoogloeoides及Acinetobacter pitii，值得注意的是由于16SrDNA在芽孢桿菌種水平鑒定的局限性，未能鑒定出蔬菜芽孢桿菌[33]，但已知從毛囊蠕形螨身上可分離培養(yǎng)出蔬菜芽孢桿菌，其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有增加中性粒細(xì)胞遷移、脫顆粒和產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，引起毛囊皮脂腺周圍炎癥[34]。另外從PPR患者的膿皰中分離出表皮葡萄球菌的純生長，因此局部皮膚血供及溫度的增加可能刺激共生菌表皮葡萄球菌發(fā)展為病原菌，導(dǎo)致了丘疹膿皰型酒渣鼻的發(fā)生[35]。這些研究結(jié)果解釋了臨床上選擇性應(yīng)用抗生素可緩解丘疹膿皰型酒渣鼻患者面部炎癥這一現(xiàn)象。

3.4 尋常型痤瘡 尋常型痤瘡是好發(fā)于青少年的一種毛囊皮脂腺的炎性病癥，雖然對其病因和發(fā)病機(jī)理尚不清楚，但微生物的參與是疾病發(fā)展的重要機(jī)制之一。其中痤瘡丙酸桿菌被認(rèn)為是重要的致病因子，現(xiàn)代免疫熒光顯微技術(shù)發(fā)現(xiàn)尋常型痤瘡患者面部毛囊皮脂腺中有更高頻率的痤瘡丙酸桿菌定植，其形成的生物膜有抵抗抗生素的能力[36,37]，同時痤瘡丙酸桿菌有強(qiáng)的免疫刺激性質(zhì)，通過Toll樣受體誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞、皮脂腺細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和防御素[38]。研究者應(yīng)用現(xiàn)代測序技術(shù)對比痤瘡患者與健康人毛囊皮脂腺中的痤瘡丙酸桿菌，其相對豐度無差異，但在菌株水平上有所不同，某些菌株和痤瘡強(qiáng)相關(guān)，而某些菌株在正常人皮膚富集[39]。另一研究指出痤瘡患者的毛囊皮脂腺中除了痤瘡丙酸桿菌外還有表皮葡萄球菌和低比例的非培養(yǎng)菌群定植，這與健康人皮脂腺中單一的痤瘡丙酸桿菌定植不同[38]。

4 宏基因組學(xué)與微生物

目前研究皮膚微生物廣泛應(yīng)用的技術(shù)是設(shè)計通用引物靶向核糖體基因(如16SrDNA、18SrDNA)完成體外擴(kuò)增后測序，而要更好地理解皮膚微生物在防止病原體和改善人類健康的作用不能局限于物種的分類學(xué)鑒定，更需要了解與功能基因相關(guān)的特定代謝活動，這一目的可以通過宏基因組的高通量鳥槍測序法實現(xiàn)[40]。

宏基因組是對環(huán)境樣品中全部微生物群的基因組進(jìn)行分析，確定完整的遺傳多樣性及預(yù)測與微生物群相關(guān)的基因功能[41]。目前皮膚微生物的宏基因組關(guān)聯(lián)分析還處于初步探索階段，現(xiàn)階段利用宏基因組學(xué)已了解到皮膚細(xì)菌主要參與分解代謝，如利用油脂作為碳源進(jìn)行甘油三脂分解代謝，也參與皮膚酸度調(diào)節(jié)。皮膚微生物的代謝活動同樣存在區(qū)域差異，油性區(qū)域表現(xiàn)為糖酵解途徑活躍，產(chǎn)生過多的ATP、GTP以及NADH脫氫酶1過度表達(dá)，干性區(qū)域以檸檬酸循環(huán)為主[40,42]。

而利用宏基因組學(xué)已對腸道微生物及相關(guān)疾病進(jìn)行了廣泛研究，腸道微生物參與能量代謝、必需氨基酸和維生素(生物素、核黃素、硫胺素、泛酸鹽、抗壞血酸鹽)合成[43,44]。肥胖癥與腸道細(xì)菌在門水平的改變，尤其是擬桿菌門和厚壁菌門，多樣性降低以及細(xì)菌基因和代謝途徑的改變相關(guān)[45,46]，2型糖尿病患者存在中度的腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌豐度降低，機(jī)會性病原體增加，參與的能量代謝、硫酸鹽還原作用和氧化應(yīng)激抗性反應(yīng)增加[47,48]，而癥狀性動脈粥樣硬化患者腸道富集柯林斯氏菌屬，肽聚糖合成增加和八氫番茄紅素脫氫酶減少，血清中的β-胡蘿卜素水平降低[49]。

5 小結(jié)

該文總結(jié)了近些年應(yīng)用現(xiàn)代測序技術(shù)研究健康人皮膚微生物組群以及與皮膚疾病相關(guān)的微生物改變，盡管分子學(xué)技術(shù)相較于培養(yǎng)法在微生物多樣性認(rèn)識上顯示出更大優(yōu)勢，但所鑒定的微生物無法區(qū)分其活性，且難以確定暫駐菌和常駐菌。目前對改變的微生物是如何導(dǎo)致或加劇這些疾病仍知之甚少，未來對人皮膚微生物組的宏基因組學(xué)研究有待于發(fā)現(xiàn)微生物與宿主、微生物與環(huán)境以及微生物群落間的相互作用，從而開發(fā)新的治療策略。

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