仙珍骨康膠囊對(duì)小鼠地塞米松骨質(zhì)疏松模型關(guān)鍵療效指標(biāo)的影響

劉 雙 潘桂海 史建強(qiáng) 周 飛 林加西 陽(yáng)慧芝 吳志華 陳嶸祎

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性疾病，目前仍然主要使用糖皮質(zhì)激素(GC)治療。而約30% SLE患者因此誘發(fā)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(Glucoeorticoid induced osteoporosis，GIOP)[1]。目前GIOP居繼發(fā)性骨質(zhì)疏松病因的第一位，較原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥更易發(fā)生骨折或股骨頭缺血壞死，甚至殘疾[2]。本課題組既往采用仙珍骨康膠囊防治SLE患者GIOP取得確切的療效，證明了中醫(yī)補(bǔ)腎健脾法組方結(jié)合糖皮質(zhì)激素治療SLE能產(chǎn)生良好的協(xié)同效應(yīng)來(lái)防治GIOP[3]。然而SLE合并GIOP的病因較復(fù)雜，為避免因患者病情、病程、糖皮質(zhì)激素劑量、遺傳背景等差異對(duì)藥物的療效造成統(tǒng)計(jì)學(xué)上的偏倚，為探討仙珍骨康膠囊防治GIOP的分子機(jī)制，本研究通過(guò)建立小鼠地塞米松骨質(zhì)疏松模型，并對(duì)關(guān)鍵療效指標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)量效研究，以探討仙珍骨康膠囊防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器 5周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠40只,體質(zhì)量15～17 g,均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,喂食普通顆粒飼料,室溫20℃左右,自然光照,保持良好通風(fēng),自由進(jìn)水進(jìn)食。主要儀器:多模式活體成像系統(tǒng)(德國(guó)BRUKER，型號(hào)In-VivoXtreme),透射電鏡(日本JEM-1400型透射電子顯微鏡)。

1.2 主要藥物和試劑 地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H12020515),仙珍骨康膠囊(由廣東醫(yī)科大學(xué)天然藥物開(kāi)發(fā)公司提供,中國(guó)專利號(hào):201410412279.4,批準(zhǔn)文號(hào):粵藥制字Z20070673)。仙珍骨康膠囊是由淫羊藿、蛇床子和珍珠層粉組成的中藥復(fù)方制劑。具有溫腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、袪風(fēng)濕等功能，適用于陽(yáng)萎遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣、婦女宮冷、寒濕帶下和中老年人骨質(zhì)疏松癥等。I型前膠原C-端肽(PICP) 、骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、雌二醇(E2)、降鈣素(CT)、甲狀旁腺激素(PTH)、孕酮(PRG)ELISA試劑盒(上海研輝生物科技有限公司), 血鈣、血磷測(cè)試盒(上海合雨生物科技有限公司), Trizol(life technologies)。

1.3 分組與造模方法 將40只C57BL/6小鼠按隨機(jī)分組設(shè)計(jì)原則，分為地塞米松組(A組)、仙珍骨康組(B組)、地塞米松+仙珍骨康組(C組)和對(duì)照組(D組)，每組10只。地塞米松組小鼠按1 mg/kg的劑量，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸鈉；仙珍骨康組以仙珍骨康混懸液22 mL/kg灌胃，每日1次；地塞米松+仙珍骨康組小鼠按1 mg/kg的劑量，每周2次臀肌注射地塞米松磷酸鈉并以仙珍骨康混懸液22 mL/kg灌胃，每日1次；對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不做處理。實(shí)驗(yàn)6周后處死全部老鼠。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 骨密度測(cè)定 處死前，給予小鼠腹腔注射10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，當(dāng)小鼠呈穩(wěn)定的昏睡狀態(tài)達(dá)到5 min以上時(shí)，利用多模式活體成像系統(tǒng)對(duì)脊柱及雙側(cè)股骨近端進(jìn)行X線攝片，利用自帶軟件進(jìn)行雙側(cè)股骨近端及L2骨密度測(cè)定。

1.4.2 透射電鏡觀察 取右側(cè)股骨的下1/3段，使用銳利器械從其冠狀面剖成兩半，3%的戊二醛固定24 h后，然后以5%的硝酸脫鈣1周，送交電鏡室行常規(guī)超薄切片、電鏡觀察。

1.4.3 血液學(xué)檢測(cè) 采用10%水合氯醛將小鼠麻醉后，采用摘除眼球的方法取血，提取血清后，置于-20℃冰箱內(nèi)保存。按試劑盒說(shuō)明書(shū)上的方法，分別測(cè)定血清甲狀旁腺激素(PTH)、I型前膠原C-端肽(PICP)、骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、雌二醇(E2)、孕酮(PRG)、降鈣素(CT)、血鈣、血磷的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠骨密度測(cè)定結(jié)果 地塞米松組股骨近端及L2的骨密度最低(P<0.01)，仙珍骨康組、地塞米松+仙珍骨康組與對(duì)照組股骨近端骨密度的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

2.2 透射電鏡觀察各組小鼠成骨細(xì)胞形態(tài) 地塞米松組見(jiàn)成骨細(xì)胞溶解，形態(tài)變長(zhǎng)；仙珍骨康組見(jiàn)成骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常, 細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻；地塞米松+仙珍骨康組見(jiàn)成骨細(xì)胞核為卵圓形，有膠原分泌；正常對(duì)照組成骨細(xì)胞可見(jiàn)有較多膠原分泌, 細(xì)胞中存在大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體(圖2)。

2.3 各組小鼠各項(xiàng)血液指標(biāo)的結(jié)果 仙珍骨康組PTH水平最高，地塞米松+仙珍骨康組次之，其次為對(duì)照組，地塞米松組最低(P<0.0001)；仙珍骨康組PICP、BALP水平最高，其次為地塞米松+仙珍骨康組與對(duì)照組，地塞米松組最低(P<0.0001)；地塞米松組BGP、E2水平最高，其次為地塞米松+仙珍骨康組和對(duì)照組，仙珍骨康組最低(P<0.0001)；仙珍骨康組PROG水平最低，其次為地塞米松+仙珍骨康組與對(duì)照組，地塞米松組最高(P<0.0001)；地塞米松組CT水平最高，對(duì)照組次之，其次為地塞米松+仙珍骨康組，仙珍骨康組最低(P<0.0001)；各組血鈣及Pi水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 德國(guó)BRUKER多模式活體成像系統(tǒng)檢測(cè)各組小鼠股骨近端及L2的骨密度

圖2 透射電鏡觀察各組小鼠成骨細(xì)胞形態(tài)

表1 各組小鼠股骨近端及L2椎體骨密度比較

表2 各組小鼠觀察血液指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前GIOP居繼發(fā)性骨質(zhì)疏松病因的第一位，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，增加家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)，如何防治SLE合并GIOP已成臨床亟待解決的難題。采用仙珍骨康膠囊防治SLE患者GIOP的確切療效，不僅證明了復(fù)方中藥制劑可有效防治GIOP，而且在GIOP發(fā)病機(jī)制的研究上取得了可喜的進(jìn)展[4,5]。本課題根據(jù)“腎主骨”的中醫(yī)學(xué)理論，腎虛是骨質(zhì)疏松的發(fā)病關(guān)鍵，若腎精充足，則筋骨堅(jiān)硬有力；腎虛則骨弱無(wú)力，故治療宜補(bǔ)腎壯骨；脾虛則后天化源不足，五臟失養(yǎng)，則導(dǎo)致腎精虧虛，骨骼失養(yǎng)，骨骼脆弱無(wú)力，最終致發(fā)生骨質(zhì)疏松癥[6]。故宜用補(bǔ)腎壯骨、益氣健脾的治療法則[7，8]。本課題構(gòu)建了糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型從骨結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)、準(zhǔn)確地觀測(cè)骨質(zhì)疏松療效指標(biāo)的變化，為仙珍骨康膠囊的應(yīng)用提供更重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并大力推動(dòng)GIOP的機(jī)制研究[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松組股骨近端及L2的骨密度最低(P<0.01)，仙珍骨康組、地塞米松+仙珍骨康組與對(duì)照組股骨近端的骨密度的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，血清指標(biāo)示血鈣與血磷濃度在各組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明仙珍骨康膠囊可能不是從影響鈣、磷離子來(lái)起到防治骨質(zhì)疏松的作用。但仙珍骨康膠囊能顯著升高小鼠血清中的PTH、PICP及BALP水平，下調(diào)BGP、E2、CT與PROG水平(P<0.01)。研究表明甲狀旁腺素類藥物比二磷酸鹽類藥物更能提高絕經(jīng)婦女骨質(zhì)疏松癥病人腰椎、股骨頸BMD，改善骨質(zhì)量的療效肯定，且安全性較高[9]。此外，亦有研究表明甲狀旁腺素能有效改善糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期應(yīng)用所造成的骨量丟失，增加骨密度，對(duì)預(yù)防糖皮質(zhì)激素所導(dǎo)致的大鼠骨質(zhì)疏松有顯著作用。甲狀旁腺素是判斷骨質(zhì)疏松關(guān)鍵指標(biāo)，仙珍骨康膠囊能顯著升高PTH水平表明該藥安全，高效，是SLE性糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松的良藥[5,7]。透射電鏡亦表明地塞米松組見(jiàn)成骨細(xì)胞溶解，形態(tài)變長(zhǎng)；仙珍骨康組見(jiàn)成骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常, 細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻；地塞米松+仙珍骨康組見(jiàn)成骨細(xì)胞核為卵圓形，有膠原分泌；對(duì)照組成骨細(xì)胞可見(jiàn)有較多膠原分泌, 細(xì)胞中存在大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體[7,9]。

總之，上述研究活體成像、生化指標(biāo)、電鏡結(jié)果進(jìn)一步闡明了仙珍骨康膠囊防治骨質(zhì)疏松的機(jī)制。表明仙珍骨康膠囊不但能顯著減低絕經(jīng)前SLE患者服用糖皮質(zhì)激素造成的骨質(zhì)疏松或骨量減少，而且糖皮質(zhì)激素耐受患者加服補(bǔ)骨膠囊后可以提高患者對(duì)糖皮質(zhì)激素的敏感性。上述研究方法為中成藥防治GIOP的研究提供了新的思路及有效的實(shí)驗(yàn)研究模型。為仙珍骨康膠囊的臨床應(yīng)用提供了大量的實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)，為其分子機(jī)制的研究提供了依據(jù)。

[1] Korczowska I, Olewicz-Gawlik A, Hrycaj P, et al.The effect of long-term glucocorticoids on bone metabolism in systemic lupus erythematosus patients: the prevalence of its anti-inflammatory action upon bone resorption[J].Yale J Biol Med,2003,76(2):45-54.

[2] Elvy Suhana MR, Farihah HS, Faizah O, et al.Effect of 11β-HSD1 dehydrogenase activity on bone histomorphometry of glucocorticoid-induced osteoporotic male Sprague-Dawley rats[J].Singapore Med J,2011,52(11):786-793.

[3] 史建強(qiáng), 陳麗娟, 許宗嚴(yán), 等.補(bǔ)骨膠囊對(duì)SLE患者激素治療后骨質(zhì)疏松的作用及細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2010,24(2):169-171.

[4] Layer T, Steele A, Goeken JA, et al.Engagement of the B cell receptor for antigen differentially affects B cell responses to Toll-like receptor-7 agonists and antagonists in BXSB mice[J].Clin Exp Immunol,2011,163(3):392-403.

[5] 史建強(qiáng), 陳秋霞, 黎兆軍, 等.丹參聯(lián)合補(bǔ)骨膠囊治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者骨質(zhì)疏松效果[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2009,9(9):1719-1720.

[6] Lu SY, Wang CY, Jin Y, et al.The osteogenesis-promoting effects of alpha-lipoic acid against glucocorticoid-inducedosteoporosis through the NOX4, NF-kappaB, JNK and PI3K/AKT pathways[J].Sci Rep,2017,7(1):3331.

[7] Burshell AL, Mφricke R, Correa-Rotter R, et al.Correlations between biochemical markers of bone turnover and bone density responses in patients with glucocorticoid-induced osteoporosis treated with teriparatide or alendronate[J].Bone,2010,46(4):935-939.

[8] 溫成平, 范永升, 唐曉頗.解毒祛瘀滋陰法防治SLE類固醇性骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2007,22(7):430-433.

[9] Sousa LH, Linhares EV, Alexandre JT, et al.Effects of atorvastatin on periodontitis of rats subjected to glucocorticoid-induced osteoporosis[J].J Periodontol,2016,87(10):1206-1216.