甜菊糖的生物合成、轉(zhuǎn)化與糖基化

吳則東 ，馬龍彪 ，周艷麗 ，張文彬

（1.黑龍江大學農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學院甜菜研究所，哈爾濱150080；

2.黑龍江大學農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學院，哈爾濱150080）

甜葉菊是產(chǎn)于巴拉圭與巴西的多年生主要的保健用草本植物，含有的調(diào)節(jié)和維持人體內(nèi)各種代謝過程所必需的重要營養(yǎng)素和礦物質(zhì)[1]。甜菊糖（steviol glycosides，SGs）以純天然、零卡路里、熱穩(wěn)定、對血糖無影響、非可發(fā)酵、酸堿性穩(wěn)定、比普通糖甜150～300倍、防齲齒、無褐變反應和無脂肪與碳水化合物十大優(yōu)點，受到全球消費與開發(fā)者的青睞[2]。甜葉菊葉片的天然成分主要是貝殼杉烯二萜苷：甜菊糖苷（stevioside，STV），萊鮑迪苷A（Reb A）、B、C、D、E，杜爾可苷A和甜菊雙糖苷。其中較甜的四環(huán)二萜甜菊糖是STV和Reb A，這些苷是由一個二萜貝殼杉烯骨架連接大量葡萄糖單元組成。幾乎30種貝殼杉烯二萜苷已從不同種甜葉菊植物中提取，通常被稱為甜菊醇糖苷（steviol glycosides），即以甜菊醇（steviol，ent-13-羥基貝杉殼烯酸）為基礎(chǔ)配糖苷，C19酯鍵參與C19安息香酸功能和葡萄糖單元之間連接，C13羥基團與葡萄糖、木糖、鼠李糖結(jié)合形成乙醚鍵。Reb A比STV有更多的葡萄糖[3]。葡萄糖和槐糖基殘基存在于STV，與糖苷配基甜菊醇連接，最后呈現(xiàn)環(huán)戊烷多氫菲的骨架。甜菊醇（steviol）的C4和C13分別與β-葡糖基和β-槐糖基團連接。Reb A與STV具有相同的基本結(jié)構(gòu)，唯一不同的是葡糖基-（1-3）-槐糖基殘基替換了槐糖基殘基[3]。STV（三糖苷甜菊醇）是最主要的貝殼杉烯型二萜苷，占干葉含量的3%～8%，Reb A比其它甜菊糖更甜、味道更美[3]。

1　甜菊糖生物合成途徑

甜菊葉的甜度是由于次生代謝物甜菊糖的存在。STV和Reb A是各種甜菊糖（SGs）的重要代謝產(chǎn)物。甜菊糖的生物合成途徑涉及16個步驟，是由眾多的酶催化，其中4個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）為UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1 和貝殼杉烯酸-13-羥化酶（KAH）[4]。與赤霉素（GA）的生物合成途徑有關(guān)[5]。甜菊糖（SGs）主要存在于甜葉菊葉片中，少量在莖中，根中幾乎沒有[6]。甜菊糖的生物合成主要涉及7個步驟與MEP（2-cmethyl-d-erythritol-4-phosphate）的異戊烯焦磷酸（IPP）、二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）和香葉基焦磷酸（GGDP）合成途徑相似[7]；隨后，接下來的4個步驟與赤霉素（GA）的生物合成途徑中涉及到從GGDP到貝殼杉烯酸的合成相似；最后5個步驟包括甜菊醇糖苷（steviol glycoside）的生物合成途徑[3]。

在柯巴基焦磷酸（CDP）合成酶（CPS）存在下，GGDP最初通過質(zhì)子化引發(fā)環(huán)化將CDP轉(zhuǎn)換為甜菊醇（steviol），隨后，貝殼杉烯合成酶（KS）產(chǎn)生貝殼杉烯。進一步，通過3步反應貝殼杉烯經(jīng)貝殼杉烯氧化酶（KO）氧化為異貝殼杉烯酸，像GA的生物合成一樣[8]。在甜葉菊植株的花、葉、肉質(zhì)莖和嫩枝中KO含量極高[5]。最后，通過異貝殼杉烯酸-13-羥化酶（KAH）作用將異貝殼杉烯酸羥基化。在這一步中，甜菊糖（SGs）生物合成與赤霉素（GA）生物合成開始分支[9]。

在細胞質(zhì)中，糖苷配基甜菊醇由不同的糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）糖基化。在甜菊醇有兩個羥基團，分別在C-4羧基的C-19位和C-13位。在UGT85C2催化下開始對甜菊醇的C-13糖基化產(chǎn)生甜菊醇單糖苷，再糖基化產(chǎn)生甜菊醇雙糖苷，UGT催化此步還沒有確定。最后，在UGT74G1催化下將甜菊醇雙糖苷C-19糖基化形成甜菊醇三糖苷（即STV）。那么，Reb A是由UGT76G1酶催化下將STV的C-13糖基化生成的[9]。

2　STV糖基化為Reb A

Reb A因其具有高甜度，口感好，口味好，無任何不良余味，是商業(yè)上最受青睞和開發(fā)價值的SGs，因此用酶催化甜葉菊葉片將STV糖基化努力提高Reb A的含量。試驗表明，添加1%可溶性淀粉、1%纖維素酶到反應混合物（0．1 M 磷酸鈉緩沖液 pH 4．6），葉片與緩沖液比為 1∶15，然后在 50℃孵育，在 100～120℃、10 kPa壓力和90 r/min 10～15 min將甜菊葉加壓熱水提?。≒HWE）SGs。結(jié)果證實，STV的糖基化轉(zhuǎn)化為Reb A，使Reb A含量從4%提高到66%。進一步凈化多柱色譜分離得到95%純Reb A。Reb A濃度與α-葡萄糖苷酶有關(guān)，抑制活性IC50=35．01lg/mL。因此，STV轉(zhuǎn)化Reb A的過程簡單、廉價和環(huán)保，具有商業(yè)潛力[10]。

甜菊葉經(jīng)纖維素酶預處理水解葉細胞壁，釋放胞內(nèi)的甜菊醇糖苷、α-淀粉酶和轉(zhuǎn)糖苷酶[11]。釋放的α-淀粉酶水解可溶性淀粉為葡萄糖釋放到介質(zhì)中，這些葡萄糖分子然后轉(zhuǎn)移到STV的C-13位由葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化而獲得高收益的Reb A，從而提高提取的SGs甜度[12]。當添加純的STV到反應混合物（含有纖維素酶和可溶性淀粉）中做底物，轉(zhuǎn)糖基化并沒有進行。這可能是反應介質(zhì)中由于缺乏胞內(nèi)酶（α-淀粉酶和糖基轉(zhuǎn)移酶）。這也證明了介質(zhì)中纖維素酶不負責STV的轉(zhuǎn)糖基催化。經(jīng)纖維素酶預處理，葉片釋放的糖基轉(zhuǎn)移酶負責催化轉(zhuǎn)糖基化反應，從而提高Reb A的生產(chǎn)[10]。

在人類，味覺接收有5種：甜、甘、苦、咸和酸。味覺受體細胞（TRCs）和信令單元已被確認在口腔、味蕾在舌[13]。甜味受體（STR）屬于G蛋白偶聯(lián)受體C類（C-GPCR）家族[14]。在異種受體hTAS1R2 and hTAS1R3蛋白相結(jié)合激活下，開始感覺甜味[15]。與甜味的單受體探測比，苦味受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體的卷曲受體家族[16]。它們表現(xiàn)出獨特的，但部分重疊分子接受范圍，因為人類苦味hTAS2R基因家族的25受體已被轉(zhuǎn)導在染色體簇 5p15、7q31 和 12p13[17]。 hTAS2Rs的氨基酸長 290～333 個，有 7 個跨膜螺旋（TM1～TM7），位于短胞外氨基端和胞內(nèi)羧基末端[18]。在25個受體中，hTAs2R4受體受STV和Reb A的活化作用參與苦味接受[19]。但是，苦味背后的分子結(jié)構(gòu)機制依舊不為人知。酶法合成引起了相當?shù)闹匾?，在綠色環(huán)保發(fā)展起重要作用。酶法改性的過程中，在一個糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個糖苷期間形成糖苷鍵[20]。R Singla等已經(jīng)開發(fā)出一種苦味受體同源性模型和測定苦味受體活化配體的結(jié)構(gòu)，提出了STV酶生物轉(zhuǎn)化Reb A的合成策略，以β-1,3-葡聚糖酶合成了Reb A。酶的糖基化需要兩個步驟，第一步是β-1,3-葡聚糖酶將凝膠多糖做供體分解為葡萄糖部分，第二步是在STV的C-3位置有選擇性進行β配置。溫度、pH值、時間、多糖和酶的濃度在產(chǎn)品產(chǎn)量起著重要的作用。STV 與多糖的比例為采取 1∶2，優(yōu)化反應條件：55℃、pH 4．5、檸檬酸緩沖液，反應時間為 3h。在 3．425單位/克酶活性下反應產(chǎn)物達最大產(chǎn)量，反應產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化，轉(zhuǎn)化率為62．5%[21]。

3　甜菊糖的生物轉(zhuǎn)化

對貝殼杉烯二萜苷的生物轉(zhuǎn)化研究表明，人類和動物中STV和Reb A可安全地代謝而未被吸收利用[22]。由于STV的分子量高，人體小腸不容易吸收，不易被胃腸道消化酶分解為甜菊醇。STV或通過盲腸或結(jié)腸的菌群降解產(chǎn)生游離甜菊醇，或在肝臟進一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸衍生物通過尿液排出[23]。體外方法測定各種消化酶消化STV的研究表明，在腸道的菌群沒有消化酶消化STV，但將其水解產(chǎn)生甜菊醇和甜菊醇-16-α-17-環(huán)氧化物，最后，甜菊醇-16-α-17-環(huán)氧化物完全轉(zhuǎn)化為甜菊醇和甜菊醇葡萄糖醛酸從尿液中排出[24]。

Reb A通過結(jié)腸微生物代謝為STV，進一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖分子和甜菊醇。結(jié)腸的細菌或Bacteroides sp．將釋放的葡萄糖分子利用而不被身體吸收進入血液和代謝成分基本上離開身體[25]。甜葉菊的最終代謝產(chǎn)物是甜菊醇，通過人的糞便，并不改變代謝濃度。主要的甜菊糖（STV和Reb A）在肝臟吸收和葡糖醛酸化，一小部分留下結(jié)腸做糞便排泄，葡糖苷酸是釋放在血液通過腎臟過濾進入尿液[26]。在個別物種STV轉(zhuǎn)化為甜菊醇比Reb A轉(zhuǎn)化為STV更快速[3]。此外，定量和定性在大鼠機體和人體的腸道（菌群）中都發(fā)現(xiàn)了相似之處。

4　甜菊糖苷的未來微生物工廠化生產(chǎn)

Reb A甜度雖高，但高濃度回味仍具苦味，Reb C的甜度僅是葡萄糖的30倍，含量低的五糖苷Reb D和六糖苷Reb M及其共混物甜度高達蔗糖的350倍，并極大降低了苦味。Reb D明顯比Reb B甜且苦味低，與Reb A、B相比，Reb M具高甜度、快速和干凈的味道，且苦味極低。這些特性使Reb D和Reb M成為優(yōu)質(zhì)的高潛力的天然甜味劑。Reb D和Reb M在甜葉菊葉含量極低（約0．5%），從甜葉菊中提取是不切實際和昂貴的。STs的Reb D和Reb M生物合成途徑已在酵母中成功表達，微生物提供了Reb D和Reb M的異源生產(chǎn)替代[27]。因此，利用微生物實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)下一代高甜度甜菊糖甜味劑，是未來的發(fā)展方向。

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