腦外傷干細胞治療進展

盧子明，陳桂增，羅灼明 （東莞市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東東莞523059）

0 引言

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是一種常見的多發(fā)病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的推測，到2020年后，顱腦損傷將成為影響人類健康及導(dǎo)致殘疾的主要原因，其給患者家庭及社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)［1］。TBI是由外傷引起正常腦功能的破壞，其可導(dǎo)致嚴重的身體、認知及情感障礙。TBI的病理生理學(xué)主要包括血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的破壞、廣泛的神經(jīng)炎癥、彌散性軸索損傷以及神經(jīng)退行性病變［2］。腦損傷的病理變化主要是組織結(jié)構(gòu)缺失、神經(jīng)細胞的破壞及內(nèi)環(huán)境紊亂，而神經(jīng)細胞的破壞是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)，現(xiàn)尚無有效的藥物治療方法［3］，目前主要的治療方法有高壓氧、無創(chuàng)性腦刺激、任務(wù)導(dǎo)向功能電刺激及行為治療等［4］。

近年來，有研究［5］發(fā)現(xiàn)多種干細胞可治療創(chuàng)傷性顱腦損傷后的神經(jīng)功能損傷，如間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）、神經(jīng)干細胞（neural stem cells， NSCs）、多潛能成體祖細胞（multipotent adult progenitor cells， MAPCs）及內(nèi)皮祖細胞（endo?thelial progenitor cells，EPCs）等。本文就近年來不同類型的干細胞治療腦外傷的作用和進展、主要不足之處及相關(guān)機制進行相關(guān)文獻綜述。

1 不同類型干細胞的治療效果

1．1 MSCs MSCs是一種異質(zhì)性的多能成體細胞，可以從骨髓、脂肪和血管周圍組織等部位分離出來［6－7］，具有定向分化為間充質(zhì)及非間充質(zhì)組織的能力，也包括神經(jīng)細胞［8］。MSCs在組織再生方面起著非常重要的作用，其可通過抑制炎癥、分泌營養(yǎng)因子（即旁分泌效應(yīng)）、募集局部祖細胞來替換丟失的細胞，從而促進受損組織的再生［9］。 有研究［10］表明MSCs可通過旁分泌的方式下調(diào)炎性蛋白的表達，加速顱內(nèi)動脈瘤的修復(fù)作用。

有研究［11］發(fā)現(xiàn)，MSCs除了具有分泌能力外，其可選擇性遷移到大鼠TBI模型的損傷腦組織中，隨后分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞修復(fù)受損腦組織，從而改善TBI模型運動功能。Zhang等［12］利用TBI大鼠模型研究MSCs的抗炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的特性，與對照組相比，MSCs治療組中TBI動物的神經(jīng)功能在3～28 d得到明顯改善，而MSCs治療組的受損腦組織含水量也顯著下降，但在腦損傷后72 h時，MSCs治療組和假手術(shù)組的腦組織含水量之間沒有顯著性差異。除此之外，他們還發(fā)現(xiàn)MSCs治療可減少損傷皮質(zhì)中小膠質(zhì)細胞或巨噬細胞、中性粒細胞、CD3＋淋巴細胞、凋亡細胞及促炎性細胞因子，從而抵抗受損腦組織的炎癥反應(yīng)［12］。 相似的，Guo等［13］通過向TBI小鼠模型注射骨髓源性MSCs進行研究，與對照組相比，MSCs治療可促進TBI小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，改善學(xué)習(xí)和記憶障礙，減少神經(jīng)細胞凋亡，其機制可能是MSCs促進TBI小鼠腦組織VEGF和Ang?1的表達及微血管的生成。除了單純將MSCs回輸至體內(nèi)治療TBI，通過在體外過表達某種基因，從而達到增強MSCs增殖、抗氧化應(yīng)激等作用的目的，然后再回輸至TBI模型體內(nèi)也是治療 TBI的一種好方案。SOD2在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，Shi等［14］通過將過表達SOD2基因的MSCs經(jīng)靜脈回輸至TBI小鼠中，發(fā)現(xiàn)其可減弱TBI小鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，維持BBB的完整，并且可加速TBI小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。

盡管有基礎(chǔ)研究［15］證實MSCs可改善TBI的神經(jīng)功能及預(yù)后，但MSCs大量應(yīng)用于臨床還是有很大的難度，因為MSCs的治療存在促進腦腫瘤生長的可能。截止目前，已經(jīng)有兩項關(guān)于MSCs治療TBI的療效及安全性的臨床研究。在其中的一項臨床研究［16］中，有7名顱腦外傷患者在顱腦手術(shù)中接受MSCs移植，術(shù)者將MSCs直接應(yīng)用于損傷腦組織中，然后將108～1010個MSCs經(jīng)靜脈回輸至TBI患者體內(nèi)；在術(shù)后6個月的隨訪中，患者的神經(jīng)功能明顯改善，并且沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)毒性跡象，但該研究的不足之處是樣本量太少，并且無對照組。而第二項臨床研究［17］則共納入了10例重度顱腦外傷患者進行Ⅰ期臨床試驗，MSCs主要通過靜脈注射或鞘內(nèi)注射，神經(jīng)功能是否得到改善主要由NIHSS量表、GCS評分及GOS評分評定。在細胞移植細胞后，血清中的神經(jīng)生長因子及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子明顯升高，并且在隨訪中，患者的神經(jīng)功能都得到了不同程度的改善，并且無死亡或不良事件發(fā)生，這為MSCs治療TBI的安全性和可行性提供了大量支持。但可惜的是，本項臨床研究與前面提到的臨床研究類似，其主要的不足也是樣本過小及無對照組。

雖然MSCs在基礎(chǔ)和臨床研究上都取得了不錯的治療效果，但其不能在TBI模型上長時間存活及可能存在免疫排斥反應(yīng)也是一個值得繼續(xù)深入研究的問題［18］。目前，細胞替換和長期移植介導(dǎo)的營養(yǎng)支持或免疫調(diào)節(jié)是MSCs的主要作用機制，但細胞存活率低、免疫排斥反應(yīng)及不能量化細胞存活率可能會影響準確評估細胞對TBI的長期修復(fù)和恢復(fù)神經(jīng)功能的能力［19］。

1．2 間充質(zhì)干細胞源性外泌體 外泌體是一種包含了各種RNA（mRNAs、miRNAs等）及蛋白質(zhì)、直徑為30～100 nm的小膜泡，其可來源于正常及病理狀態(tài)下的多種細胞［20］。外泌體具有重要的臨床價值，比如其表面標志物及分子可作為一些疾病潛在的診斷性標志物［21］，其不僅具有低免疫性及在外周循環(huán)中半衰期較長的特點，而且還具有穿過血腦屏障的能力［21］。與其它類型的細胞相比，MSCs能夠產(chǎn)生大量的外泌體，并且提取出的外泌體在形態(tài)特征、分離及儲存方法上與其它細胞來源的外泌體并沒有明顯差別［22］。

除了將MSCs通過不同途徑移植至TBI動物模型體內(nèi)進行治療，Zhang等［23］通過從MSCs提取外泌體，然后將外泌體蛋白通過尾靜脈回輸至TBI動物模型中，發(fā)現(xiàn)外泌體治療組中TBI大鼠的神經(jīng)功能可得到顯著改善，其機制可能與外泌體促進內(nèi)源性血管生成和神經(jīng)發(fā)生，減輕TBI后炎癥反應(yīng)有關(guān)。接著，他們又通過對比二維與三維膠原支架培養(yǎng)的外泌體在治療TBI療效上的差異，發(fā)現(xiàn)三維膠原培養(yǎng)的外泌體在改善TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)及空間學(xué)習(xí)能力方面的效果更好［24］。 類似的，最近的一項研究［22］利用小鼠TBI模型進行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)MSCs源的外泌體治療后可減輕TBI后認知功能的損害。除了MSCs源性外泌體可改善TBI功能，Xin等［25］發(fā)現(xiàn)外泌體也可顯著促進大鼠腦卒中模型神經(jīng)功能的恢復(fù)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，外泌體治療可顯著增強腦卒中模型中神經(jīng)軸突重建、神經(jīng)發(fā)生和血管生成。

與移植外源性干細胞相比，MSCs源性外泌體移植在修復(fù)受損腦組織上具有以下幾個優(yōu)勢：（1）不存在倫理問題；（2）侵襲性較小；（3）較低或無免疫原性；（4）較低或無致瘤性［26］。

目前，國內(nèi)外研究中尚未有關(guān)于MSCs源性外泌體治療TBI的臨床研究，因外泌體治療TBI的具體機制仍尚未完全清楚，所以對其修復(fù)TBI后受損腦組織的具體機制的研究是其應(yīng)用于臨床的必要步驟。

1．3 NSCs NSCs是一種具有自我更新能力，可進一步分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞的干細胞。由于宿主的免疫排斥反應(yīng)，人類細胞移植至TBI動物模型中長期存活是很難實現(xiàn)的，Haus等［19］則通過制作一種新的具有免疫缺陷的TBI大鼠模型，并將人NSCs移植至該模型中，并長時間（大于或等于2個月）觀察腦損傷后認知功能的恢復(fù)，發(fā)現(xiàn)9%～25%的NSCs被移植至TBI模型中至少存活了5個月，并且可分化為成熟的神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞及少突細胞；該研究提示移植人NSCs可能是一種有效的、可長期治療腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的方法。此外，通過轉(zhuǎn)染攜帶促進生長的相關(guān)基因從而增強NSCs的增殖、分化等功能，然后將該NSCs移植至TBI模型體內(nèi)也是治療TBI的一種有效方法。在Philips等［27］的研究中，向TBI模型注射已轉(zhuǎn)染攜帶神經(jīng)生長因子基因的病毒的NSCs可明顯提高海馬區(qū)錐體細胞存活率，并且TBI模型認知、學(xué)習(xí)能力及運動神經(jīng)功能也得到明顯恢復(fù)。目前，主要通過立體定向注射和側(cè)腦室注射兩種方法移植NSCs至TBI動物模型中，而通過側(cè)腦室注射的NSCs在體內(nèi)存活率更高［28］。除了NSCs移植的方法，移植的時間也是影響NSCs治療TBI效果的關(guān)鍵因素，TBI后兩天及一周內(nèi)注射NSCs的療效明顯比兩周后的好，而TBI后一個月才使用NSCs進行治療則對TBI模型的運動及認知功能的恢復(fù)無明顯效果［29］。

目前，NSCs應(yīng)用于臨床試驗主要受限于NSCs難以大量培養(yǎng)、生產(chǎn)。最近，有一項關(guān)于利用人NSCs治療慢性頸脊髓損傷的臨床研究［30］，雖然該研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)NSCs治療后神經(jīng)功能總體上得到了恢復(fù)，但仍需增加樣本及對照組方能進一步明確其療效。

1．4 MAPCs MAPCs在 2002年被首次報道，因其具有可分化為間充質(zhì)細胞、臟壁中胚層、神經(jīng)外胚層及內(nèi)胚層的特點而備受關(guān)注，且其分化潛能并不會因持續(xù)增殖而丟失［31］。MAPCs是一類與MSCs明顯不同的細胞群，因為MAPCs的MHC I型表面蛋白表達量較低，并且其具有更強的分化為內(nèi)皮細胞的能力［32］。截止目前，只有國外的一個研究團隊利用SD大鼠［33－34］及小鼠［35］模型研究人類 MAPCs 治療 TBI，他們分別于TBI后2 h及24 h經(jīng)靜脈向TBI模型注射106個MAPCs，發(fā)現(xiàn)MAPCs治療腦外傷120 d后可改善其空間學(xué)習(xí)、信息保持、記憶檢索和運動障礙能力，并且可維持腦外傷急性期血腦屏障的完整［36］，其主要機制可能是通過上調(diào)抗炎癥反應(yīng)因子的表達來對抗損傷引起的炎癥反應(yīng)［33］。

1．5 iPSCs iPSCs最早于2006年被報道，是由兩位日本科學(xué)家利用病毒載體將轉(zhuǎn)錄因子Oct3／4、Sox2、c?Myc和Klf4轉(zhuǎn)入已分化的體細胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細胞的一類細胞［37］。此類細胞可從患者提取，然后在體外經(jīng)重編程生成iPSCs，再回輸給患者本人，從而避免了倫理問題及免疫排斥反應(yīng)，其具有自我更新及分化為各類細胞的能力，因此有很好的臨床應(yīng)用前景。

最近，Cary等［38］通過取一位腦外傷后患有嚴重認知功能障礙的患者的硬腦膜，然后從中提取成纖維細胞，最后通過轉(zhuǎn)染攜帶非整合的仙臺病毒后可獲得iPSCs。對于需要手術(shù)的腦外傷患者，取硬腦膜進行培養(yǎng)是獲取iPSCs的很好的途徑。Kobayashi等［39］利用脊髓損傷狨猴模型進行研究，作者發(fā)現(xiàn)移植的人源的iPSCs可在動物體內(nèi)存活并且可分化為三種神經(jīng)細胞系，可促進軸突再生，而且還具有防止腦組織損傷的神經(jīng)保護功能。Gao等［40］利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將四個轉(zhuǎn)錄因子 Oct4、Sox2、Klf4和 c?Myc及反應(yīng)性膠質(zhì)細胞重編程至iPSCs，發(fā)現(xiàn)此類iPSCs可分化為大量的NSCs，并且可進一步分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞，從而修復(fù)TBI受損腦組織。Lyu等［41］利用TBI模型進行研究，發(fā)現(xiàn)iPSCs源性A2B5＋細胞移植至腦損傷區(qū)后可有效改善神經(jīng)功能障礙，其機制主要與lncRNA和mRNA的表達變化有關(guān)。相似地，Wei等［42］和Dunkerson等［43］利用動物TBI模型進行研究，也發(fā)現(xiàn)iPSCs移植治療可顯著改善TBI后認知及運動功能。iPSCs除了可促進外傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，還可作為治療亨廷頓病的重要選擇。An等［44］利用人亨廷頓病細胞模型進行研究，并從亨廷頓病患者中提取成纖維細胞重編程最終獲取iPSCs，發(fā)現(xiàn)iPSCs可改變亨廷頓病細胞模型的表型，且可進一步分化為紋狀體神經(jīng)元。

雖然 iPSCs有許多優(yōu)點，但是也存在很多不足［45］。首先，由于這種細胞是由病毒的感染而重編程生成的，其具有一定的致瘤性，并且其由體細胞重編程生成的效率較低。再者，因為這種由再編程生成的細胞具有未知的遺傳和表觀遺傳背景，所以在臨床中使用iPSCs之前需要仔細評估其安全性問題。

1．6 EPCs EPCs是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，主要存在于骨髓中，是一種具有游走特性，能進一步分化為血管內(nèi)皮細胞的祖細胞，可參與胚胎期血管生成和出生后血管新生。在生理或病理因素刺激下，EPCs在某些趨化因子和粘附分子的作用下可從骨髓動員進入外周血，自發(fā)地向內(nèi)皮損傷的部位募集，參與內(nèi)皮修復(fù)［46］，尤其是發(fā)生腦外傷后［47］。

外周血EPCs數(shù)量的變化可作為BBB是否被破壞的標志［48］。此外，EPCs在 TBI后24 h內(nèi)顯著升高，而外周血中EPCs數(shù)量相對較低的TBI患者可提示該患者預(yù)后相對較差［49］。BBB主要由腦血管微血管內(nèi)皮細胞組成，Boyer?Di等［50］研究發(fā)現(xiàn)某些特定條件可誘導(dǎo)EPCs向BBB方向分化。內(nèi)皮細胞集落形成細胞（endothelial colony?forming cells， ECFCs）又稱“晚期內(nèi)皮祖細胞”或“內(nèi)皮外向生長細胞”，是EPCs的一種亞型，最早由Lin等［51］報道。在腦損傷模型中，通過腦室注射臍帶血源的ECFCs發(fā)現(xiàn)其可歸巢至腦損傷區(qū)域參與BBB的修復(fù)并增強新生血管生成［52］。激活Notch通路可增強EPCs的遷移及管腔形成能力，而通過激活TBI動物模型體內(nèi)EPCs的Notch通路則可促進受損腦組織血管的形成及腦組織的修復(fù)［53］。為了追蹤EPCs在損傷腦組織中分布，明確EPCs是否的確遷移至受損腦組織參與修復(fù)，有學(xué)者利用GFP及BrdU雙標記EPCs，從而發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈注射后的EPCs可歸巢至損傷腦組織，促進海馬神經(jīng)發(fā)生及血管再生，并可顯著改善TBI后的神經(jīng)功能［54］。 Xue等［55］則通過從脂肪組織中分離培養(yǎng)出EPCs進行研究，發(fā)現(xiàn)EPCs可聚集在損傷腦組織并參與毛細血管形成，并且可減少星型膠質(zhì)細胞增生及減輕炎癥反應(yīng)。相似的，Chen等［56］分別于創(chuàng)傷性腦損傷后6 h及12 h后分別向TBI模型注射經(jīng)SPIO標記的EPCs，發(fā)現(xiàn)在1周后受損腦組織區(qū)域腦血液灌注恢復(fù)及微血管明顯增加。因外周血中EPCs數(shù)量極少，所以通過體外EPCs移植可能是促進創(chuàng)傷性腦損傷患者神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)功能恢復(fù)的一個有效方法。此外，通過外源性藥物增強外周血EPCs的遷移能力及管腔形成能力，也可促進TBI后神經(jīng)功能的恢復(fù)，如促紅細胞生成素［57］及孕激素［58］。

TBI后腦白質(zhì)是否減少是影響患者生存和預(yù)后的重要指標［59］。血管可為軸突的生長和發(fā)育提供結(jié)構(gòu)性支撐，同時也起著運輸氧和清除代謝廢物的作用。鑒于血管細胞在軸突發(fā)育及體內(nèi)平衡中發(fā)揮著重要作用，因此有學(xué)者推測EPCs在腦發(fā)生病變時其起著介導(dǎo)病變局部血管生成的作用，并利用TBI動物模型進行研究，證實了EPCs可維持TBI后腦白質(zhì)的完整性及減少毛細血管的破壞［60］。

目前，雖然大量的基礎(chǔ)實驗證實EPCs移植治療可顯著改善TBI后神經(jīng)功能，但是其療效及安全性仍有待進一步的臨床研究。

2 結(jié)論與展望

盡管目前在創(chuàng)傷性腦損傷方面，無論是病理生理學(xué)的復(fù)雜性還是干細胞療法在治療中的應(yīng)用方面，都進行了大量的基礎(chǔ)研究，但仍有許多問題亟待解決，以確定促進腦功能組織恢復(fù)的最佳方法。雖然目前已經(jīng)有干細胞治療TBI后腦損傷的臨床研究，并且均取得了良好的治療效果，但樣本量尚不夠大，而且缺乏對照試驗。因此，所有可能影響TBI治療效果的研究和干預(yù)措施都需要進行多中心的長期隨訪和隨機前瞻性試驗，這將對我們能否為不同TBI人群制定合適的治療方案產(chǎn)生巨大的影響及起著非常重要的作用。盡管大量的基礎(chǔ)研究證實干細胞治療顱腦損傷有較好的效果，但是干細胞的安全性、注射途徑、注射時間及具體的機制等問題都是影響干細胞能否應(yīng)用于臨床關(guān)鍵的因素，也是以后研究的重點。