雙酚A聯(lián)合己烯雌酚對(duì)未成年雌性SD大鼠的雌激素效應(yīng)

王 娟，劉文龍，趙 苒，范 春

(1. 廈門(mén)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，福建 廈門(mén) 361023； 2. 福建省廈門(mén)市婦幼保健院兒童發(fā)育行為科，福建 廈門(mén) 361003；3. 廈門(mén)大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102)

環(huán)境雌激素(environmental estrogens,EEs)是廣泛存在于自然界并能影響人類(lèi)健康的一大類(lèi)外源性化學(xué)物的總稱(chēng)，主要來(lái)自塑料增塑劑、洗滌劑和阻燃劑等化學(xué)制品，按其化學(xué)結(jié)構(gòu)差異分為雙酚類(lèi)、烷基酚類(lèi)和鄰苯二甲酸酯類(lèi)等。雌激素樣污染物進(jìn)入環(huán)境后，造成人群多途徑混合暴露，并在生態(tài)系統(tǒng)中通過(guò)食物鏈蓄積，最終損害人類(lèi)健康[1-2]。由于環(huán)境污染的復(fù)雜性和多樣性，僅就單一物質(zhì)評(píng)價(jià)EEs的危害效應(yīng)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的[3-4]。從人群實(shí)際暴露情況來(lái)看，聯(lián)合作用的研究對(duì)于深入了解EEs危害程度及危害機(jī)制均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，但目前相關(guān)報(bào)道較少。本研究擬選擇具有雌激素樣作用的雙酚A (bisphenol A，BPA) 和己烯雌酚 (diethylstilbestrol，DES) 作為受試物，采用子宮增重實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)BPA和DES的聯(lián)合雌激素效應(yīng)，為深入探討EEs對(duì)機(jī)體健康影響的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 70只未成年雌性SD大鼠(21 d)，體質(zhì)量30～40 g，購(gòu)自四川抗生素工業(yè)研究所(合格證：川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第15號(hào))。按改良配方，飼以不含植物雌激素的飼料。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，動(dòng)物自由攝食和飲水，室溫20℃～23℃，相對(duì)濕度50%～70%，12 h/12 h明暗周期。動(dòng)物按體質(zhì)量采用區(qū)組隨機(jī)分組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分為200、400和800 mg·kg-1BPA組，15和150 μg·kg-1DES組，BPA+DES聯(lián)合組(100 mg·kg-1BPA + 7.5μg·kg-1DES，200 mg·kg-1BPA + 7.5 μg·kg-1DES，400 mg·kg-1BPA + 7.5 μg·kg-1DES，400 mg·kg-1BPA + 75.0 μg·kg-1DES)，同時(shí)設(shè)花生油溶劑對(duì)照組，每組7只。

1.2 主要試劑 BPA購(gòu)自上海試劑一廠，DES購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，以市售花生油作為溶劑。

1.3 染毒方法 各組大鼠根據(jù)分組情況，按1 mL·100 g-1灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥3 d。給藥期間每天稱(chēng)大鼠體質(zhì)量，并按體質(zhì)量調(diào)整給藥量，觀察陰道開(kāi)口情況。于末次給藥后24 h股動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，迅速剝離子宮，在電子天平上稱(chēng)濕質(zhì)量(結(jié)果以mg表示)，以15%甲醛固定。

1.4 取材制片 大鼠子宮固定3 d后，將子宮分為3段：輸卵管端、宮體端和陰道端，于同一水平面垂直石蠟包埋。連續(xù)切片，厚5 μm，共3片/側(cè)子宮角。染色后鏡檢。

1.5 染色方法 ① HE染色：按常規(guī)HE染色操作；②凡氏染色：采用苦味酸酸性復(fù)紅法進(jìn)行平滑肌特殊染色。

1.6 各組大鼠子宮形態(tài)計(jì)量 ①宮腔上皮厚度：每組切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，200倍鏡下觀察，測(cè)量宮腔上皮高度，取平均值，結(jié)果以μm表示；②宮腔平滑肌厚度：每組切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，200倍鏡下觀察，測(cè)量宮腔平滑肌厚度，取平均值，結(jié)果以μm表示；③宮腔腺體數(shù)量：每組切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算5個(gè)視野的總面積，并統(tǒng)計(jì)其中的子宮腺體總數(shù)，計(jì)算單位面積下的子宮腺體數(shù)量，以個(gè)/μm2表示；④成熟卵泡數(shù)量：每組切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算5個(gè)視野的總面積，并統(tǒng)計(jì)其中的成熟卵泡總數(shù)，計(jì)算單位面積下的成熟卵泡數(shù)量，以個(gè)/μm2表示。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況和體質(zhì)量變化 單獨(dú)或聯(lián)合給予DES和BPA染毒，大鼠均出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡和被毛蓬松無(wú)光澤等表現(xiàn)，各組大鼠體質(zhì)量增加與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量

GroupBody weight Before exposureAfter exposureIncreased weightControl32.07±5.6435.42±7.683.35±2.06BPA (mg·kg-1) 20034.27±7.8739.62±8.625.35±1.85 40034.66±7.9632.28±5.552.62±1.54 80035.87±7.0139.62±14.724.75±3.14DES (μg·kg-1) 1532.60±3.1836.38±7.963.78±1.01 15036.11±6.1339.83±10.503.72±1.40BPA(mg·kg-1) + DES (μg·kg-1) 100.0+7.533.82±5.6237.02±4.233.20±1.89 200.0+7.533.88±4.0436.90±4.863.02±1.62 400.0+7.532.10±4.7137.16±4.635.06±0.96 400.0+75.034.23±4.0739.58±5.755.35±4.33

2.2 各組大鼠子宮大體形態(tài)表現(xiàn) 與對(duì)照組比較， 800 mg·kg-1BPA組大鼠子宮濕質(zhì)量和子宮/體質(zhì)量比明顯增加(P<0.05)；與對(duì)照組比較，各劑量DES組大鼠子宮不僅明顯增大，而且出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，隨著劑量的增加，各劑量DES組大鼠子宮濕質(zhì)量和子宮/體質(zhì)量比明顯增加(P<0.05)。同時(shí)給予BPA和DES染毒，與對(duì)照組比較，各劑量聯(lián)合組大鼠子宮明顯增大，子宮濕質(zhì)量和子宮/體質(zhì)量比明顯增加 (P<0.05)，但與各劑量DES組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。見(jiàn)表2和圖1(插頁(yè)一)。

2.3 各組大鼠子宮組織病理形態(tài)表現(xiàn) 與對(duì)照組比較， 800 mg·kg-1BPA組大鼠子宮腔上皮高度增加，但仍為單層立方狀上皮，宮腔平滑肌層變厚；各劑量DES組和各劑量聯(lián)合組大鼠子宮腔上皮高度明顯增加，表現(xiàn)為柱狀上皮，子宮腔擴(kuò)張，固有層和肌層分層好，平滑肌層明顯增厚，平滑肌細(xì)胞特征明顯，腺體數(shù)量增加(圖2，見(jiàn)插頁(yè)一)。與對(duì)照組比較，800 mg·kg-1BPA組、各劑量DES組和各劑量聯(lián)合組大鼠宮腔上皮高度、平滑肌層厚度和宮腔腺體數(shù)量均明顯增加 (P<0.05)，但各劑量聯(lián)合組與各劑量DES組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠子宮濕質(zhì)量和子宮/體質(zhì)量比

GroupUterine weight (m/mg)Ratio of uterine weight to body weight (η/‰)Control23.55±9.460.66±0.20BPA (mg·kg-1) 20028.00±9.840.66±0.11 40034.40±6.880.92±0.10 80044.50±10.95?1.09±0.23?DES (μg·kg-1) 15128.60±32.99?3.59±0.88? 150134.33±41.85?2.99±1.22?BPA(mg·kg-1) + DES (μg·kg-1) 100.0+7.5141.60±32.39?3.80±0.57? 200.0+7.5147.80±17.41?4.05±0.60? 400.0+7.5124.60±21.66?3.42±0.89? 400.0+75.0138.17±42.62?3.58±1.33?

*P<0.05 compared with control group.

2.4 各組大鼠卵巢發(fā)育情況 與對(duì)照組比較，各劑量BPA組大鼠成熟卵泡數(shù)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，800 mg·kg-1BPA組大鼠宮腔腺體數(shù)量增加(P<0.05)，各劑量 DES組大鼠宮腔腺體數(shù)量和成熟卵泡數(shù)量均明顯增加(P<0.05)。與對(duì)照組比較，同時(shí)給予BPA和DES后，各聯(lián)合組大鼠宮腔腺體數(shù)量和成熟卵泡數(shù)量明顯增加(P<0.05)，但與各劑量DES組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠宮腔上皮高度、平滑肌厚度、宮腔腺體數(shù)量和成熟卵泡數(shù)量

GroupHeight of luminal epithelium(l/μm)Thickness of myometrium(l/μm)Amount of uterine glands(μm-2)Amount of mature follicle(μm-2) Control11.76±3.0849.87±6.121.33±0.581.33±0.58BPA (mg·kg-1) 20014.40±4.2155.39±14.881.00±0.521.33±1.16 40014.86±2.2158.52±2.491.33±0.531.67±0.58 80021.33±3.56?85.78±10.41?3.33±0.58?2.67±0.58DES (μg·kg-1) 1564.93±5.41?168.63±11.73?6.00±1.73?4.67±0.58? 15064.71±12.88?172.19±19.79?5.67±1.53?4.33±2.08?BPA(mg·kg-1) + DES (μg·kg-1) 100.0+7.569.45±6.06?175.42±22.88?5.33±3.51?5.33±3.22? 200.0+7.571.23±12.01?164.77±7.73?5.67±1.53?6.33±1.53? 400.0+7.565.07±4.57?166.41±12.08?5.67±1.00?5.67±2.31? 400.0+75.064.76±5.54?161.23±13.93?5.00±1.00?5.33±1.16?

*P<0.05 compared with control group.

2.5 各組大鼠陰道開(kāi)口情況 單獨(dú)或聯(lián)合給予BPA和DES，各組大鼠陰道開(kāi)口率均為0，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有受試物均未使大鼠陰道開(kāi)口提前，即所有受試物均未明顯促進(jìn)陰道的發(fā)育。

3 討 論

子宮增重實(shí)驗(yàn)是篩檢雌激素活性化合物體內(nèi)試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。子宮含有豐富的雌激素受體，在未成年雌性大鼠子宮生長(zhǎng)靜止期(postnatal day,PND 17～26 d)給予受試物即可以檢測(cè)出雌激素樣物質(zhì)[5-6]。傳統(tǒng)的子宮增重實(shí)驗(yàn)采用子宮濕(干)質(zhì)量和子宮臟器系數(shù)作為檢測(cè)終點(diǎn)。隨著該方法的應(yīng)用增多，人們發(fā)現(xiàn)雌激素除了能引起子宮質(zhì)量增加外，還可以引起子宮組織和細(xì)胞水平的改變，故可通過(guò)測(cè)定宮腔上皮高度、宮腔平滑肌厚度和宮腔腺體數(shù)量等來(lái)評(píng)價(jià)外來(lái)化合物的雌激素樣作用。本研究結(jié)果顯示：?jiǎn)为?dú)給予800 mg·kg-1BPA后，未成年雌性SD大鼠子宮增大，宮腔上皮高度和宮腔平滑肌厚度增加，宮腔腺體數(shù)量增加；單獨(dú)給予DES染毒后，各劑量DES組大鼠子宮反應(yīng)更為強(qiáng)烈，即使在15 μg·kg-1劑量組中，大鼠宮腔上皮也明顯增高，上皮細(xì)胞從單層立方狀變?yōu)橹鶢?，平滑肌層厚度增加，出現(xiàn)了明顯的平滑肌細(xì)胞特征，表明BPA和DES在本實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出了雌激素樣作用，DES的雌激素活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于BPA，至少為BPA雌激素活性的10 000倍，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]一致。

隨著EEs研究的逐漸深入，研究者發(fā)現(xiàn)某些物質(zhì)在單獨(dú)作用時(shí)雌激素活性很弱，但混合后卻出現(xiàn)協(xié)同作用，尤其是“Something from Nothing”現(xiàn)象的出現(xiàn)引起了研究者對(duì)EEs 聯(lián)合毒性作用的關(guān)注[2,9]。EEs種類(lèi)繁多，造成人類(lèi)處于混合暴露狀態(tài)，由于聯(lián)合作用機(jī)制尚不清楚，且研究結(jié)論[10-12]并不一致，因此加強(qiáng)EEs聯(lián)合作用的研究十分必要。BPA是工業(yè)制造中一類(lèi)重要的增塑劑，DES則是一種人工合成非甾體類(lèi)雌激素，均可通過(guò)雌激素受體產(chǎn)生雌激素活性[13-14]?？紤]到二者具有相似的作用機(jī)制，有學(xué)者[15-16]研究了低劑量BPA和DES的聯(lián)合暴露效應(yīng)，結(jié)果顯示:BPA和DES的聯(lián)合暴露對(duì)雄性大鼠睪丸及附睪有明顯毒害作用，對(duì)大鼠精子活動(dòng)能力及激素水平也有明顯的影響，呈現(xiàn)出聯(lián)合效應(yīng)。為了進(jìn)一步深入探討B(tài)PA和DES的聯(lián)合作用，本研究采用子宮增重實(shí)驗(yàn)對(duì)BPA和DES的聯(lián)合雌激素效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：各劑量聯(lián)合組大鼠子宮濕質(zhì)量、子宮/體質(zhì)量比、子宮腔內(nèi)膜上皮高度和平滑肌厚度與單獨(dú)應(yīng)用DES組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下BPA和DES聯(lián)合后并未出現(xiàn)協(xié)同或拮抗效應(yīng)，僅為簡(jiǎn)單的相加作用。如果2種毒物作用機(jī)制相同，聯(lián)合后常表現(xiàn)為協(xié)同作用；若作用機(jī)制不同，其聯(lián)合作用常表現(xiàn)為相加作用。BPA和DES可通過(guò)相同途徑產(chǎn)生作用，其相加作用可能由于DES在單獨(dú)作用時(shí)已表現(xiàn)出很強(qiáng)的雌激素活性，子宮均出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，即DES在15 μg·kg-1劑量時(shí)其活性已達(dá)到最大值，活性不會(huì)再隨著劑量的增加而增大，甚至達(dá)到某一劑量時(shí)反而出現(xiàn)抑制，故可能DES完全掩蓋BPA的效應(yīng)，聯(lián)合后表現(xiàn)為相加作用。

由于EEs作用途徑眾多，作用機(jī)制復(fù)雜，要了解環(huán)境化合物的雌激素效應(yīng)及其與疾病發(fā)生的關(guān)系，應(yīng)結(jié)合更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究和流行病學(xué)調(diào)查資料才能作出正確評(píng)價(jià)。