鴨圓環(huán)病毒病原學(xué)特性及分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展

李天芝 ，于新友 ，張穎

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

鴨 圓 環(huán) 病 毒 病 （Duck circovirus disease，DuCVD）是由鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）感染引起的一種免疫抑制性疾病[1]。各品種和日齡鴨均可感染發(fā)病，臨床表現(xiàn)為羽毛發(fā)育不良、脫落、消瘦、貧血、生長緩慢、飼料轉(zhuǎn)化率降低等[2]。單純感染該病毒時(shí)，一般僅造成鴨零星死亡，但該病毒感染后可造成鴨免疫抑制，容易混感或繼發(fā)其它疾病，致鴨死亡率升高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。2003年德國學(xué)者Hattermann等首先報(bào)道該病[3]，隨后世界各地均有相關(guān)報(bào)道，2006年Chen等在我國臺(tái)灣地區(qū)檢測到DuCV感染，2008年傅光華等首次在我國大陸地區(qū)番鴨中檢測到DuCV感染[4]，隨后山東、福建、浙江、江蘇、廣東等省陸續(xù)有相關(guān)報(bào)道。近年來DuCV在我國鴨群中的感染及混合感染病例呈上升趨勢[5]，引起獸醫(yī)界高度關(guān)注，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。本文綜述了DuCV的病原學(xué)特性及分子生物學(xué)檢測方法研究進(jìn)展作一簡要概述，以期為該病的快速診斷和防控提供參考。

1 病原學(xué)特性

DuCV屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，病毒粒子呈圓形或二十面體對稱，無囊膜，直徑約為15～16nm，是目前已知最小的鴨病毒。病毒對外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，鴨群一旦感染后很難清除。目前，尚不能在體外培養(yǎng)。Du CV單鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組長約 2.0kb，有2個(gè)主要的閱讀框，ORFV1和ORFC1，分別編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白和核衣殼蛋白Cap蛋白，病毒可分為DuCV-1和DuCV-2兩個(gè)不同的基因型。

2 分子生物學(xué)檢測方法

2.1 核酸探針 核酸探針技術(shù)是常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，它具有操作簡單、不受抗原抗體反應(yīng)的限制、結(jié)果易于判定等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層推廣使用。Zhang等[6]利用PCR方法擴(kuò)增出DuCV基因片段約228bp，然后用地高辛標(biāo)記，建立斑點(diǎn)雜交方法，最小可檢測13.2pg DuCV目的基因片段。鄒金峰等[7]用地高辛標(biāo)記DuCV全基因組克隆制成核酸探針，與鴨病毒性肝炎Ⅰ型病毒的cDNA、鴨瘟病毒的DNA和DuCV的DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交以檢測核酸探針的特異性，結(jié)果該探針只與DuCV的DNA雜交呈陽性。敏感性結(jié)果表明，該探針對DuCV的最低檢出量約為5pg DuCV的DNA。

2.2 常規(guī)PCR方法 PCR方法是根據(jù)目的片段設(shè)計(jì)引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴(kuò)增部分或全部目的片段，是一種快速、簡便、特異的診斷方法。李志國等[8]根據(jù)DuCV Cap蛋白基因序列設(shè)計(jì)了4條特異性引物，建立了可以同時(shí)檢測2種基因型DuCV的雙重PCR檢測方法。結(jié)果顯示，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，最低可檢測到1拷貝的DuCV核酸。使用建立的雙重PCR方法對收集的山東省6個(gè)鴨群150只病死雛鴨的組織DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示有50.0%(3/6)的鴨群檢出DuCV-1和 DuCV-2的混合感染，33.33%(2/6)的鴨群檢出DuCV-2的單獨(dú)感染。

2.3 套式PCR方法 套式PCR，又稱巢式PCR。使用兩對PCR引物擴(kuò)增完整的片段，以第一對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，檢測的特異性更好，敏感性也更高。柴順秀等[9]根據(jù)GenBank登錄的DuCV保守區(qū)基因組序列，設(shè)計(jì)合成內(nèi)、外2對引物，通過PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測DuCV的巢式PCR檢測方法。該方法對鴨病毒性肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨細(xì)小病毒、新城疫病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，第1輪擴(kuò)增的靈敏度為10pg，第2輪擴(kuò)增的靈敏度為0.1pg，通過巢式PCR，敏感性提高了100倍。蔡銳等[10]根據(jù)GenBank發(fā)布的DuCV序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)2對引物，建立了適合DuCV快速檢測的套式PCR方法，采用該方法對從安徽省望江縣采集的發(fā)病鴨肝臟、胸腺、法氏囊、腎臟和脾臟等內(nèi)臟病料進(jìn)行DuCV檢測。結(jié)果顯示，套式PCR對所有內(nèi)臟病料均能擴(kuò)增出340bp的條帶，而正常鴨胚、健康鴨肝臟、鴨瘟病毒、禽流感病毒(H9亞型)、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒、雞傳染性貧血病毒、鴨源大腸桿菌和鴨疫里氏桿菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，該方法第1次擴(kuò)增的敏感性是1ng，第2次擴(kuò)增的敏感性是1fg，第2次比第1次擴(kuò)增的敏感性高106倍。

2.4 多重PCR方法 多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，它在同一PCR體系中，加入多對引物，同時(shí)檢測2種或2種以上的病毒DNA，它具有快速、靈敏度高、高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于臨床的快速診斷。許宗麗等[11]為了建立能同時(shí)檢測鴨源新城疫病毒(DuNDV)、鴨瘟病毒和DuCV的方法，根據(jù)DuNDV、DPV和DuCV基因的保守序列設(shè)計(jì)了3對特異性引物，預(yù)特異擴(kuò)增DuNDV片段大小為823bp，DPV為576bp和DuCV為338bp。經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了DuNDV、DPV和DuCV的三重PCR檢測方法。該方法特異性好，對鴨的其他病原檢測結(jié)果為陰性，敏感性高，DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低檢出限分別為2.59×103、1.12×103、4.67×102拷貝/μl。 張艷芳等[12]針對 Gen Bank中坦布蘇病毒E基因和DuCV REP基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成了2對引物，通過優(yōu)化反應(yīng)體系條件及特異性、敏感性評價(jià)，建立了鴨坦布蘇病毒和DuCV的二重RT-PCR方法。結(jié)果表明：該方法對鴨坦布蘇病毒和DuCV的檢測敏感性達(dá)到100fg，使用該方法對新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、番鴨細(xì)小病毒、番鴨呼腸孤病毒、H9亞型禽流感病毒和減蛋綜合征病毒的檢測結(jié)果全為陰性。曹慧慧等[13]為建立能同時(shí)檢測并區(qū)分DuCV和鵝圓環(huán)病毒(Goose circovirus，GoCV)的方法，根據(jù)DuCV和GoCV基因組的保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩對特異性引物，預(yù)期特異性擴(kuò)增DuCV和GoCV片段大小分別為192bp、556bp。經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了DuCV和GoCV的雙重PCR檢測方法。特異性檢驗(yàn)表明該方法無法擴(kuò)增其他水禽病原，DuCV和GoCV的最低檢出限分別為 104拷貝/μl和 105拷貝/μl。

2.5 熒光定量PCR方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。趙光遠(yuǎn)等[14]根據(jù)GenBank中DuCV基因序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)了1對引物，建立了SYBER GreenⅠ熒光定量PCR檢測DuCV的方法。結(jié)果：該方法可檢測到每個(gè)反應(yīng)相當(dāng)于1×102個(gè)拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品DNA。與H9亞型禽流感、小鵝瘟、鴨瘟、鴨肝炎病毒等不發(fā)生交叉反應(yīng)，且具有良好的重復(fù)性。許宗麗等[15]根據(jù)鴨副黏病毒(DPMV)和DuCV保守基因序列，設(shè)計(jì)了2對特異性引物和2條的TaqMan探針，建立了鴨副黏病毒和DuCV的二重?zé)晒舛縋CR檢測方法。該方法敏感性好，對鴨副黏病毒和DuCV的檢測敏感性分別達(dá)到160和140個(gè)拷貝數(shù)，該方法特異性強(qiáng)，對鴨肝炎病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原體的檢測全為陰性。劉玲鳳等[16]為實(shí)現(xiàn)對DuCV的快速檢測，分析比對Gen Bank中登錄的DuCV全基因組序列，在其保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成一對特異性引物，建立了DuCV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，重復(fù)性和靈敏性檢測結(jié)果表明重復(fù)性良好，檢測下限為67.2拷貝/μl，將建立的DuCV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法分別對鴨肝炎病毒(DHV)、大腸桿菌、新城疫病毒(NDV)、H9亞型禽流感病毒、小鵝瘟病毒(GPV)核酸或cDNA進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果表明特異性良好。

2.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一項(xiàng)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。趙光遠(yuǎn)等[17]根據(jù)GenBank中 DuCV基因序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)了6條特異性引物，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種適用于DuCV的LAMP檢測方法。該方法對H9亞型禽流感、小鵝瘟、鴨瘟、鴨肝炎、鴨副黏病毒均無擴(kuò)增反應(yīng)，且擴(kuò)增反應(yīng)只需在常規(guī)水浴鍋中進(jìn)行，1h內(nèi)即可完成反應(yīng)，對DuCV模版DNA的最小檢測限為10fg，靈敏度是一步法PCR的1000倍。

3 小結(jié)

DuCV是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，對其研究還不太深入，目前尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有電鏡觀察，分子生物學(xué)診斷和間接ELISA方法。電鏡法對儀器要求高，一般實(shí)驗(yàn)室很難達(dá)到，不能廣泛應(yīng)用。間接ELISA方法雖然一次能處理大量樣品，但還沒有商品化的試劑盒，且鴨群感染后抗體能持續(xù)很長時(shí)間，因此，檢測抗體抗性并不能說明鴨處于發(fā)病期。分子生物學(xué)檢測針對病原檢測，發(fā)病期鴨組織器官中含大量病毒，且能排毒，在臨床檢測中具有重要的意義，檢測時(shí)一定要選取正確的靶器官，常選取發(fā)病初期鴨法氏囊、脾臟、肝臟等組織，病健交界部位，樣品應(yīng)新鮮，盡快送實(shí)驗(yàn)室檢測，全程保持低溫，避免樣品腐敗變質(zhì)。分子生物檢測法種類繁多，各有利弊，探針法雖能檢測大量樣品，但操作繁瑣；常規(guī)PCR大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都能開展，但檢測敏感度低，不能定量；熒光PCR操作簡便，對儀器和人員要求高；LAMP方法檢測速度快，適合基層用，但前期研發(fā)困難，檢測容易出現(xiàn)假陽性，不同實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身的條件進(jìn)行選擇適合的方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不久的將來，一批新型便攜式儀器將被研發(fā)出現(xiàn)，從而出現(xiàn)一些敏感性更高、特異性好、價(jià)廉，可操作性強(qiáng)、適合廣泛推廣應(yīng)用的新方法、新技術(shù)，為DuCVD的防控工作奠定基礎(chǔ)。