雞肌纖維發(fā)育相關(guān)基因研究進(jìn)展*

王巧巧 ，王亞南 ，唐輝 ，王金忠 ，高翔 ，李顯耀

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東省動物生物工程與疾病控制實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000；2.鄄城鴻翔牧業(yè)有限公司，山東 荷澤 274600）

肌肉發(fā)生是指在胚胎發(fā)育的過程中，體節(jié)細(xì)胞經(jīng)過一系列的增殖、遷移、分化，最終形成肌肉組織的過程，其中還包括成體表型的維持與組織再生。肌肉發(fā)生可大致分為以下三個階段：①定向分化階段：具有多能干細(xì)胞特質(zhì)的體節(jié)細(xì)胞在來自周邊組織及自身信號的誘導(dǎo)下分化形成成肌細(xì)胞；②細(xì)胞增殖和遷移階段：位于胚胎不同部分的成肌細(xì)胞保持著分裂和自身增殖能力，同時成肌細(xì)胞遷移到正在發(fā)育中的肢芽處并排列在一起；③終極分化階段：成肌細(xì)胞相互融合，形成多核的肌管，最終形成肌肉組織。在雞胚胎發(fā)育和肌肉發(fā)生過程中，成肌細(xì)胞通過增生、轉(zhuǎn)移、貼附和融合等多個過程最終形成多核的肌管，肌管在繼續(xù)分化成成熟的肌纖維，肌纖維的發(fā)育過程在出生時基本完成。出生后肌纖維的生長是通過肌纖維肥大過程而使體積增大，在這一過程中衛(wèi)星細(xì)胞核被募集到肌纖維內(nèi)。而肌纖維的增大和肥大是受到細(xì)胞外因子調(diào)控的。

在除魚類以外的脊椎動物中，成年動物中骨骼肌纖維的數(shù)量主要由胚胎期和胎兒期形成的骨骼肌纖維數(shù)量決定。出生后骨骼肌[1]的發(fā)生主要由位于肌膜和基底膜之間的衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖和分化，最后與胚胎期和胎兒期形成的肌纖維融合使骨骼肌纖維增粗，直徑增加。

1 肌肉生長抑制素(MSTN)

肌肉生長抑制素 (myostatin，MSTN又名GDF-8)屬于轉(zhuǎn)化生長因子-beta(TGF-β)超家族，是骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子，其功能是負(fù)向調(diào)控骨骼肌的生長和發(fā)育。MSTN基因在肌肉發(fā)生、生長發(fā)育、再生、萎縮和退化等過程中均扮演著重要角色。目前，MSTN基因也是許多研究者為了大幅度提高畜禽肌肉產(chǎn)量和改善肉品質(zhì)研究的首選基因。MSTN基因序列在不同物種間呈高度保守性，滿朝來等[2]對克隆家鴨、家鵝等的MSTN的cDNA作了研究并比較了人、雞、家鴨、家鵝等物種間MSTN基因的同源性，發(fā)現(xiàn)禽類間MSTN基因在DNA水平上的同源性高，一致性達(dá)到92%以上；禽類與哺乳類MSTN基因的一致性約為80%。雞MSTN基因定位在7號染色體，全長5491bp，由3個外顯子 （長度分別為373bp、373bp和382bp）和2 個內(nèi)含子（2094bp 和 2269bp）構(gòu)成[3]。

有研究表明MSTN能夠抑制雞成肌細(xì)胞的增生和分化[4]。梁耀偉等[5]利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了雞、鵪鶉及其雜交禽的胚胎肌肉發(fā)育情況，證實(shí)了MSTN mRNA表達(dá)與成肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期的時間規(guī)律一致。McFarland等研究發(fā)現(xiàn)不同肌肉組織的衛(wèi)星細(xì)胞對MSTN反應(yīng)存在差異，雞的胸大肌和股二頭肌反應(yīng)敏感，且內(nèi)源性MSTN是通過自分泌來調(diào)節(jié)肌肉生長的。為進(jìn)一步研究MSTN抑制成肌細(xì)胞生長和分化的機(jī)制。有研究表明，MSTN基因與肌源性決定基因(MyoD)的功能相關(guān)，并認(rèn)為MSTN可能是MyoD的下游靶基因，MyoD可以通過調(diào)控MSTN基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的細(xì)胞周期。Joulia研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)的MSTN能使 MyoD蛋白表達(dá)水平降低并改變其磷酸化狀態(tài)，從而抑制肌細(xì)胞分化[6]。顧志良等發(fā)現(xiàn)MSTN基因在肉雞與蛋雞中的表達(dá)量存在明顯差異，其蛋白表達(dá)水平不同，推測MSTN基因是影響肉用性狀的重要候選基因之一[7]。朱智等利用PCRRFLP方法揭示雞MSTN基因外顯子上的2個多態(tài)性位點(diǎn)對腹脂率、腹脂重、胸肌重等屠宰性狀有顯著的影響[8]。

肌細(xì)胞生長抑制素通過負(fù)向控制肌細(xì)胞的生長發(fā)育，MSTN基因缺失的小鼠表現(xiàn)出 “雙肌現(xiàn)象”[9]。從成年小鼠的皮膚中敲除MSTN基因會導(dǎo)致突變小鼠骨骼肌體積的大小是相應(yīng)野生型小鼠骨骼肌的2～3倍。這是由于肌纖維直徑增大和肌纖維數(shù)量的增加而引起的[10]。MSTN基因敲除小鼠脛骨前肌肌纖維的數(shù)量比相應(yīng)野生型小鼠多86%[11]。MSTN基因敲除小鼠和“雙肌?！惫趋兰±w維增多，揭示MSTN在骨骼肌發(fā)生的過程中起著非常重要的作用。MSTN除調(diào)控肌肉生長外，還具有調(diào)控脂肪代謝的功能[12]。

2 生肌調(diào)節(jié)因子

調(diào)節(jié)肌肉生成的因子主要包括生肌調(diào)節(jié)因子Myogenic regulatory factors（MRFs）家族和 Pax 家族的因子，其中以生肌調(diào)節(jié)因子為中心，其他因子通過MRFs家族的一個或多個因子間接調(diào)節(jié)肌肉的形成，且這些因子與肌纖維的數(shù)量和大小都有密切關(guān)系[13]。生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族，通過調(diào)節(jié)肌肉分化階段特異性蛋白的表達(dá)來參與肌細(xì)胞的決定和分化，它們的聯(lián)合作用誘導(dǎo)前成肌細(xì)胞分化發(fā)育形成肌纖維。MRFs家族包括肌分化因子MyoD、肌細(xì)胞生成素MyoG（Myogenin）、生肌決定因子Myf5和MRF4（Myf6）四個轉(zhuǎn)錄因子[14]。生肌決定因子(MyoD)家族基因?qū)儆诨镜穆菪?環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子，它是激活肌肉生成的特定基因。

2.1 MyoD基因 MyoD基因的全稱是Myogenic Differentiation Antigen(成肌分化抗原)，是以其命名的生肌調(diào)節(jié)因子家族(Myogenic regulatory factors，MRFs)的重要成員。Megeney等利用雜交方法將MyoD基因定位于人類的第11號染色體上，還利用小鼠的探針做了檢測并顯示出相同的結(jié)果[15]。Scrable(1990)同時檢測了小鼠和人的定位情況，將小鼠的MyoD定位于第7號染色體，并且觀察到了它與乳酸脫氫酶A的連鎖[16]。MyoD家族蛋白結(jié)構(gòu)上的最大特點(diǎn)是含有β-HLH結(jié)構(gòu)域，所以從結(jié)構(gòu)上看，它們屬于HLH轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。

Tapscott(1988)發(fā)現(xiàn)將小鼠的MyoD基因轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞中可以誘導(dǎo)其出現(xiàn)成肌作用，這是MyoD基因功能研究的出發(fā)點(diǎn)。這與在非洲爪蟾和斑馬魚中的現(xiàn)象一致，從而證實(shí)了在哺乳動物中MyoD與肌肉發(fā)育緊密的相關(guān)性[17]。

Sartorelli(1999)發(fā)現(xiàn)MyoD的乙?；c它的成肌作用有密切的關(guān)系。它是通過PCAF基因在保守的半光氨酸殘基上加上乙?；鶃韺?shí)現(xiàn)[18]。乙?；腗yoD與目的DNA片段結(jié)合更緊密，用其它氨基酸替代保守位點(diǎn)使得它無法乙?；螅杉≌T導(dǎo)作用下降和轉(zhuǎn)錄活性的消失顯示了乙?；瘜yoD的重要性。體內(nèi)免疫系統(tǒng)激活會使TNF和干擾素γ的水平上升，這也是導(dǎo)致重癥患者肌肉萎縮的重要原因。在肌肉發(fā)育初級階段，MyoD1和Myf5對成肌前體細(xì)胞的分化及成肌細(xì)胞的增殖具有重要作用[19]，肌纖維生成在分子水平上受到MyoD1和Myf5基因的精確調(diào)控，肌纖維的肥大體現(xiàn)在肌纖維直徑的變粗，肌纖維的肥大和肌纖維的類型與肉質(zhì)緊密相關(guān)。

有研究者認(rèn)為，MyoD1和Myf5在不同類型肌肉組織中有不同的表達(dá)模式，這種差異緣于肌肉組織起源的差異。胸肌和腿肌在起源和形成過程中存在一定的差異，胸肌主要是由軸下生肌節(jié)的成肌細(xì)胞融合而成，腿肌則是由軸下生肌節(jié)的成肌細(xì)胞遷移到肢芽處而分化形成。Braun和Rudnick等證實(shí)，單獨(dú)敲除MyoD基因的小鼠與單獨(dú)敲除Myf5基因的小鼠均有正常的肌肉形成，但聯(lián)合敲除MyoD和Myf-5基因的小鼠最終并無肌肉形成[20-21]。Kiefer等研究表明通過Myf5過量表達(dá)和低表達(dá)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Myf5在脊椎動物的生肌過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是在肌分化階段。Cooper等[22]認(rèn)為，MyoD和Myf5之間可能存在負(fù)反饋調(diào)控環(huán)，Myf5促進(jìn)MyoD基因的表達(dá)，而MyoD又抑制Myf5基因的表達(dá)。

2.2 Myf5基因 雞的Myf5基因位于1號染色體，Myf5基因的DNA序列長為1220bp，由3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成。根據(jù)GenBank上發(fā)布的序列，人的Myf5基因位于12號染色體上，家鼠的Myf5基因位于10號染色體上。豬的Myf5基因位于5號染色體上。

MyoD家族基因?qū)ι〖?xì)胞發(fā)生起重要調(diào)節(jié)作用，可激活靜止?fàn)顟B(tài)的肌肉特有基因與肌肉特有的增強(qiáng)子結(jié)合共同促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞分化[23-24]。用基因敲除實(shí)驗(yàn)表明，缺乏MyoD的小鼠沒有肌肉形成，沒有肌肉標(biāo)志(marker)出現(xiàn)，也沒有myogenin促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄過程。如僅有Myf6而沒有MyoD基因的小鼠，僅表達(dá)半量的Myf5和MyoG RNA。如敲除MyoG基因，在胚胎鼠正常數(shù)目的肌細(xì)胞發(fā)生部位可產(chǎn)生幾乎正常數(shù)目的成肌細(xì)胞，但不能向肌細(xì)胞分化。意味著MyoG位于MyoD的下游，在成肌細(xì)胞向肌小管分化的過程中具有獨(dú)特的功能。Myf6亦位于其他生肌bHLH因子的下游，在肌纖維的形成和肌肉表型的維持中起作用。綜上所述，MyoD與Myf6更具有同源性，在成肌過程中具有更重要作用。

2.3 MyoG基因 MyoG基因正向調(diào)控骨骼肌發(fā)育，在調(diào)控中胚層細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞，肌細(xì)胞分化及成肌細(xì)胞融合后在肌纖維中發(fā)揮重要作用[25]。MyoG作為生肌調(diào)節(jié)因子之一，可調(diào)Myf6基因和肌肉特異基因的表達(dá)。因此，MyoG基因的遺傳變異被認(rèn)為與肌肉的生成相關(guān)，并最終導(dǎo)致產(chǎn)肉量與肉質(zhì)的變異[26]。

MyoG基因在所有骨骼肌中均可表達(dá)，控制整個肌肉的發(fā)育過程，是骨骼肌分化的必須因子。MyoG在同種動物的不同發(fā)育時期，不同性別、同種動物的不同類型的肌肉組織中具有不同的表達(dá)規(guī)律。在胚胎發(fā)育過程中，MyoG mRNA一般處于高表達(dá)狀態(tài)，出生后，由于神經(jīng)植入骨骼肌，對骨骼肌內(nèi)MyoG的表達(dá)產(chǎn)生明顯的抑制作用，MyoG的表達(dá)隨即下降。據(jù)報道，肌細(xì)胞成熟過程中從體節(jié)細(xì)胞分化成為成肌細(xì)胞時不需要MyoG蛋白，但成肌細(xì)胞融合并分化為成熟骨骼肌細(xì)胞階段需要MyoG蛋白的調(diào)節(jié)，即MyoG基因只有在成肌細(xì)胞融合發(fā)生后形成肌細(xì)胞的過程中表達(dá)，且受MyoD及Myf5表達(dá)的誘導(dǎo)[27]。

王瓊等[28]分析優(yōu)質(zhì)肉雞MyoG基因，表明MyoG基因的2個多態(tài)位點(diǎn)變異對雞胸肌率、腿肌率等屠宰性狀及肌纖維的密度具有顯著的影響，MyoG基因與雞肌肉生長發(fā)育有關(guān)，且該基因的變異可能與肌纖維的變異有關(guān)聯(lián)。MyoG基因是火雞肌細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵。Liu等[29]利用培養(yǎng)肌衛(wèi)星細(xì)胞通過qRT-PCR檢測不同火雞品種MyoG的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MyoG基因在胸肌中的表達(dá)在不同品系、不同性別及生長時期存在差異。MyoG基因表達(dá)量不同會導(dǎo)致肌肉生長過程中出現(xiàn)肌肉超常增生和肥大，且會影響肌肉的生長速率、初生重、胚胎的死亡率等。姜浩[30]利用失神經(jīng)小鼠得到小鼠MyoG基因序列。

2.4 Myf6基因 雞Myf6基因在1號染色體上，DNA長為1836，由2個外顯子和1個內(nèi)含子。豬和牛的Myf6基因均在5號染色體上，小鼠的Myf6基因在10號染色體上。Myf6基因在生物進(jìn)化過程中具有較高的保守性，在不同物種間Myf6基因的氨基酸序列具有較高的相似性，對于Myf6基因編碼的氨基酸序列而言，豬與人的同源性達(dá)到97%，而牛和豬的同源性最高達(dá)到97%。Myf6基因是豬成年期時與成長和肉品質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因。

Myf6的外顯子是基因中的編碼區(qū)，它的長短直接影響著基因表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能[31]。內(nèi)含子是基因中的非編碼區(qū)，一般在轉(zhuǎn)錄后加工過程中被剪切掉，不少研究表明內(nèi)含子可能在基因的表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。Myf6亦位于其他生肌bHLH因子的下游，在肌纖維的形成和肌肉表型的維持中起作用[32]。而Myf6更具同源性，控制肌肉分化Myf6基因在肌肉的生成過程中是非常重要的，它與肌纖維的數(shù)量和大小均有關(guān)系。

Myf6基因在肌肉的生成過程中是非常重要的，它與肌纖維的數(shù)量和大小均有關(guān)系，因此對它的研究將會對畜禽的產(chǎn)肉力、肉質(zhì)以及風(fēng)味等的改善都具有十分重要的意義。

3 Pax基因家族

Pax基因是因?yàn)榫幋a128個氨基酸的成對結(jié)構(gòu)域而得名的，Pax基因編碼重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Pax家族中 Pax-3、Pax-7、Pax-9均表達(dá)于生皮肌節(jié)細(xì)胞，其中Pax3與Pax7對脊椎動物肌肉的形成起重要作用。

Pax3與Pax7同屬Pax基因家族的Ⅲ組，它們通過與靶基因啟動子區(qū)域結(jié)合促進(jìn)DNA-蛋白質(zhì)起始復(fù)合物的形成，從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，激活肌肉形成。在哺乳動物中，Pax3及Pax7基因與肌肉纖維的衛(wèi)星細(xì)胞的融合密切相關(guān)，從而導(dǎo)致纖維膨大[33]；另外，在肌肉受到損傷時表達(dá)活性會顯著增加，目前的研究顯示Pax3的表達(dá)激活MyoD基因控制脊椎動物四肢肌肉的發(fā)育，而 Pax7則更多地與肌肉損傷修復(fù)所關(guān)聯(lián)，這2個基因都在雞的肌肉生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[34]。

3.1 Pax3 Pax3基因的表達(dá)存在一定的組織特異性，王聰睿等研究發(fā)現(xiàn)Pax3 mRNA在雞胚脊髓內(nèi)呈區(qū)域狀特異分布[35]。Otto等研究表明，Pax3基因在胚胎期和出生后的表達(dá)水平有較大差異[36]。常國斌等發(fā)現(xiàn)，在胸肌與腿肌組織中，Pax3表達(dá)高峰時間略有差異，腿肌Pax3基因在出雛前后達(dá)到高峰，而胸肌在胚胎期第8天達(dá)到高峰，在胚胎第8天后直至成年雞的肌肉纖維數(shù)量就不再變化。在不同性別之間，胸肌與腿肌組織Pax3基因的表達(dá)呈現(xiàn)一致的趨勢，但表達(dá)水平存在一定差異，表明Pax3基因表達(dá)存在組織特異性，且集中在胚胎期大量表達(dá)，揭示該基因可能對雞肌纖維生長發(fā)育存在調(diào)控作用[37]。

3.2 Pax7 Pax7蛋白含結(jié)構(gòu)包含一個配對框(PD)、一個同源結(jié)構(gòu)域(Homeodomain，HD)、一個保守的八肽結(jié)構(gòu)(Octapeptide，OP)以及八個或九個外顯子編碼的轉(zhuǎn)活區(qū) (Transactivation domain，TD)[38]。Pax7屬于Pax基因家族的第Ⅲ組，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌的發(fā)育有關(guān)，是強(qiáng)有力的生肌性誘導(dǎo)物，能使多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯⌒约?xì)胞，在骨骼肌的發(fā)育和再生過程中起著至關(guān)重要的作用。

Pax7主要通過與靶基因的啟動子區(qū)結(jié)合改變下游基因轉(zhuǎn)錄活性來執(zhí)行其功能[39]。脊椎動物Pax7基因在胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)管形成、神經(jīng)嵴發(fā)育、近軸中胚層發(fā)育中起重要作用，能促進(jìn)幼年小鼠、魚類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，該基因突變后可能會引起嚴(yán)重的器官發(fā)育缺陷。在成年鼠視神經(jīng)損傷的修復(fù)、人、小鼠、魚類等骨骼肌發(fā)育與自我更新、肌肉損傷的再生與修復(fù)等過程中也起重要作用。Pax7基因可以通過誘導(dǎo)MyoD[40]和Myf5基因的表達(dá)，以及與Pax3基因相互調(diào)控來參與骨骼肌的發(fā)育，是治療肌肉發(fā)育障礙及肌肉萎縮等肌肉疾病的靶基因。

4 總結(jié)

雞肌纖維生長發(fā)育規(guī)律與肌肉品質(zhì)密切關(guān)聯(lián)，特別是肌纖維的總量、肌纖維密度、肌節(jié)長度等有顯著相關(guān)性，而雞骨骼肌的肌纖維總量在出殼后以恒定，雞早期骨骼肌生長過程中肌纖維的發(fā)育受到多種因子的影響。生肌調(diào)節(jié)因子家族(Myf5、Myf6、MyoD1、MyoG)和 Pax家族相互影響共同調(diào)節(jié)肌纖維發(fā)育，影響肌肉重量和肉品質(zhì)。

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