非洲豬瘟流行現(xiàn)狀分析及診斷方法研究進(jìn)展

祖立闖，李 嬌，謝金文，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

非洲豬瘟（African swine fever,ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，臨床上以豬高熱、食欲廢絕、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官出血、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主要特征，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，在我國(guó)被列為一類動(dòng)物疫病[1-3]。該病病程極短、死亡率極高，已對(duì)發(fā)病國(guó)家的養(yǎng)豬業(yè)造成了災(zāi)難性的打擊[4-5]，2018年7月末，遼寧省沈陽(yáng)市發(fā)生首例非洲豬瘟疫情[6]，非洲豬瘟對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的危害與日劇增。本文分析了ASF流行現(xiàn)狀，并對(duì)我國(guó)研究學(xué)者在ASF各種診斷技術(shù)方面取得的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，對(duì)加強(qiáng)我國(guó)ASF診斷技術(shù)的儲(chǔ)備以及制定ASF防控措施均具有一定的參考價(jià)值。

1 非洲豬瘟流行現(xiàn)狀分析

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，病毒基因組全長(zhǎng)170～190 kb，為有囊膜的雙股線狀DNA病毒，病毒粒子大小為175～215 nm，呈正二十面體結(jié)構(gòu)[2，5]。該病毒可使各種日齡和品種的家豬與野豬感染并發(fā)病，病毒可在多數(shù)蜱種中增殖，使蜱成為病毒的貯藏宿主和主要傳播媒介[7]。該病毒最早于1921年在非洲東部肯尼亞首次被發(fā)現(xiàn)，隨后開始在撒哈拉以南的非洲東部、中部、南部等地區(qū)蔓延。1957年病毒從非洲的安哥拉傳到歐洲的西班牙，病毒開始在歐洲呈零星、持續(xù)流行。1971年病毒從西班牙傳入南美洲的古巴，南美洲和拉丁美洲的多數(shù)國(guó)家陸續(xù)暴發(fā)疫情。2007年病毒傳入歐亞接壤的高加索地區(qū)，隨后開始向俄羅斯南部地區(qū)擴(kuò)散流行，2017年傳播至俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)伊爾庫(kù)茨克，導(dǎo)致傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)空前升高。2018年7月末，遼寧省沈陽(yáng)市一養(yǎng)豬戶飼養(yǎng)的豬陸續(xù)發(fā)生不明原因死亡，病死豬剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟異常腫大，疑似非洲豬瘟病毒感染，經(jīng)國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心檢測(cè)，確診為非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性，通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)引起該疫情的非洲豬瘟病毒B646L/p72基因序列與俄羅斯毒株100%匹配，與俄羅斯和東歐目前流行的格魯吉亞毒株（Georgia 2007）屬于同一進(jìn)化分支[6]，這是我國(guó)發(fā)現(xiàn)的首例非洲豬瘟，我國(guó)政府通過(guò)采取疫點(diǎn)和疫區(qū)內(nèi)所有生豬撲殺措施，疫情得到了有效控制。

2 非洲豬瘟病毒的診斷方法

2.1 PCR方法

PCR方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，是目前最簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，但該方法的敏感性有限，且擴(kuò)增后電泳檢測(cè)需要使用溴化乙錠。吳憶春[8]通過(guò)人工合成ASFV VP73基因中保守性較強(qiáng)的基因片段，將其克隆入pET-32a載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pETVP73，再根據(jù)GenBank中公布的ASFV的VP73基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以重組質(zhì)粒為模板，優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件，建立了檢測(cè)ASFV的PCR方法，并組裝了PCR檢測(cè)試劑盒。該P(yáng)CR試劑盒可特異性擴(kuò)增出429 bp的ASFV VP73基因片段，檢測(cè)豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、健康豬和蜱的基因組均為陰性，試劑盒的敏感性可達(dá)0.1 fg，試劑盒批內(nèi)和批間的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，試劑盒分別置于4℃和-20℃條件下保存12個(gè)月后穩(wěn)定性無(wú)明顯改變。該ASFV PCR檢測(cè)試劑盒為我國(guó)ASFV的快速診斷及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了重要的技術(shù)儲(chǔ)備。楊吉飛等[9]建立的ASFV PCR檢測(cè)方法檢測(cè) PPV、PCV2、PRV、口蹄疫病毒（FMDV）、CSFV、PRRSV、豬水皰病病毒（SVDV）、副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌、豬衣原體、健康豬、蜱均為陰性，能夠檢測(cè)到0.2 fg的重組質(zhì)粒核酸，檢測(cè)西班牙食品與農(nóng)業(yè)技術(shù)研究院動(dòng)物健康研究中心和歐盟非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)的17個(gè)ASFV毒株均為陽(yáng)性，檢測(cè)國(guó)內(nèi)收集的50份豬和30份蜱的野外樣品基因組均為陰性。該P(yáng)CR檢測(cè)方法具有很好的應(yīng)用性，可以有效地應(yīng)用于ASF的診斷以及防控。

2.2 納米PCR方法

納米PCR技術(shù)是一種新型的PCR技術(shù)，將固體納米金屬顆粒懸浮在液體里形成納米流體，由于納米流體熱導(dǎo)性強(qiáng)，使PCR體系能夠更快地達(dá)到目標(biāo)溫度，減少在非目標(biāo)溫度的停留時(shí)間，在提高PCR反應(yīng)特異性的同時(shí)增加了特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量，使納米PCR檢測(cè)的敏感性大幅提高，但納米PCR方法擴(kuò)增后仍然需要使用溴化乙錠進(jìn)行電泳檢測(cè)。崔尚金等[10]采用納米金顆粒作為熱導(dǎo)介子，建立了ASFV的高效納米PCR檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)大腸桿菌、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、豬捷申病毒（PTV）、豬腦心肌炎病毒（EMSV）均為陰性，敏感性是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的1 000倍，其最低核酸拷貝數(shù)檢出量可以達(dá)到10個(gè)拷貝，該方法對(duì)黑龍江、吉林和河南3個(gè)省份的8個(gè)地區(qū)臨床送檢的69份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，表明以上3個(gè)地區(qū)均未發(fā)現(xiàn)ASFV感染情況，納米PCR檢測(cè)方法為ASFV的診斷提供了新技術(shù)。

2.3 熒光定量PCR方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是將光譜技術(shù)引入到PCR反應(yīng)中，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化定量測(cè)定特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量，解決了常規(guī)PCR方法敏感性低和電泳檢測(cè)中溴化乙錠對(duì)環(huán)境的污染問(wèn)題。李洪利等[11]根據(jù)GenBank中23株編碼ASFV結(jié)構(gòu)蛋白p72的基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針，優(yōu)化退火溫度、Mg2+濃度、引物和探針濃度，建立了檢測(cè)ASFV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，該方法重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于1.3%，敏感性試驗(yàn)最低能夠檢測(cè)到10拷貝/μL 的質(zhì)粒，檢測(cè) CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV等5種豬病病毒均為陰性，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是一種能夠快速、靈敏、特異地檢測(cè)ASFV的方法。王建華等[12]根據(jù)ASFV CP530R基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物和探針，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)ASFV的TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法，該方法僅對(duì)ASFV發(fā)生特異性擴(kuò)增反應(yīng)，不與 PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬流感病毒（SIV）發(fā)生交叉反應(yīng)，該方法最低可檢測(cè)到61個(gè)拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照分子，該方法4次重復(fù)性檢測(cè)的變異系數(shù)均小于2.0%，應(yīng)用該方法對(duì)126份進(jìn)口豬的血液樣品和38份豬肉樣品進(jìn)行ASFV檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。熒光定量PCR方法敏感性高、特異性強(qiáng)，將逐步成為ASFV的臨床診斷、檢疫、食品安全檢驗(yàn)的重要方法。

2.4 等溫?cái)U(kuò)增方法

等溫?cái)U(kuò)增方法是一種新興的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，等溫?cái)U(kuò)增方法不需要PCR中的變性、退火步驟即可完成對(duì)靶序列的循環(huán)擴(kuò)增，大幅縮短了時(shí)間，整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間一般少于60 min，而常規(guī)PCR方法的反應(yīng)時(shí)間一般需要2 h以上，且使反應(yīng)能夠在恒溫條件下進(jìn)行，對(duì)儀器設(shè)備要求低，不需要昂貴的儀器設(shè)備，一臺(tái)水浴鍋即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。等溫?cái)U(kuò)增方法非常適合于ASFV的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷，但等溫?cái)U(kuò)增方法的靈敏度較高，易導(dǎo)致假陽(yáng)性的擴(kuò)增結(jié)果。目前，ASFV的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增（RPA）兩種。王華等[13]通過(guò)對(duì)ASFV p72蛋白基因序列進(jìn)行分析，根據(jù)p72保守區(qū)序列設(shè)計(jì)合成了內(nèi)、外2對(duì)引物，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測(cè)ASFV的LAMP方法，該方法在62℃保溫60 min即可完成，最低可檢測(cè)到1×101拷貝/μL的病毒DNA，比常規(guī)PCR方法的靈敏度高100倍。對(duì)ASFV、PCV2、PPV、PRV基因組DNA同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果僅有ASFV出現(xiàn)條帶，而其他均未出現(xiàn)目的條帶。表明ASFV-LAMP診斷方法具有較好的特異性、敏感性和臨床適用性。王建昌等[14]基于ASFV p72基因保守序列，設(shè)計(jì)并合成引物，建立了檢測(cè)ASFV的RPA方法，該方法在38℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)30 min即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的有效擴(kuò)增，僅特異性擴(kuò)增 ASFV p72基因，對(duì) FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2均沒(méi)有擴(kuò)增，對(duì)p72重組質(zhì)粒檢測(cè)的限達(dá)到102拷貝。RPA方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、檢測(cè)成本低、結(jié)果確實(shí)可靠，為ASF的一線防控提供了一種新的、可靠的技術(shù)支持。

2.5 ELISA方法

ELISA方法高通量、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單，是目前常用的免疫學(xué)診斷技術(shù)，可用于豬群中ASFV感染的大規(guī)模調(diào)查，但作為血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，該方法具有一定的滯后性，無(wú)法對(duì)ASFV的早期感染做出診斷。梁云浩等[15]利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出ASFV P54蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示重組蛋白的大小約為25 ku，Western-blot試驗(yàn)證實(shí)重組蛋白具有良好的抗原性，以P54重組蛋白作為檢測(cè)抗原包被酶標(biāo)板，通過(guò)優(yōu)化各反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)ASFV血清抗體的間接ELISA方法，該方法檢測(cè)CSFV、PRRSV、FMDV、SIV、PRV、豬肺疫、豬丹毒陽(yáng)性血清均為陰性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1∶320，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%，具有敏感性高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。靳雯雯等[16]利用原核系統(tǒng)表達(dá)的VP73蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)ASFV抗體的間接ELISA方法，該方法對(duì)ASFV陽(yáng)性血清的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1∶2 560，檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎、CSFV、PRV、FMDV、PRRSV 陽(yáng)性血清均為陰性，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，包被好的酶標(biāo)板37℃放置5 d后檢測(cè)的敏感性無(wú)明顯變化，相對(duì)于進(jìn)口ELISA試劑盒的特異性和敏感性分別為99.1%和94.3%，符合率為98.0%，具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性、穩(wěn)定性，可以滿足臨床ASF抗體檢測(cè)的需求。

2.6 膠體金試紙檢測(cè)方法

膠體金試紙檢測(cè)方法是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，利用層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)抗原抗體特異性檢測(cè)的一種新型的免疫檢測(cè)技術(shù)。該方法具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合臨床的快速診斷，但該方法的敏感性較高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。張?chǎng)斡畹萚17]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了ASFV p54重組蛋白，利用His親和層析成功純化了p54蛋白，將純化蛋白利用膠體金標(biāo)記后噴涂于玻璃纖維墊，分別以葡萄球菌A蛋白（SPA）和抗p54多克隆抗體作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，制備了檢測(cè)ASFV p54抗體的膠體金免疫層析試紙，該試紙條的敏感性為200 ng/mL，檢測(cè) CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV2 陽(yáng)性血清均為陰性，采用該膠體金試紙條和ELISA方法檢測(cè)24份ASFV弱毒免疫后第13天的豬血清樣品（由英國(guó)Pirbright研究所OIE ASF參考實(shí)驗(yàn)室提供），膠體金試紙條的檢出陽(yáng)性率為100%，而ELISA檢出陽(yáng)性率為33.3%。ASFV抗體免疫層析檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)，在5～10 min內(nèi)可以判定結(jié)果，適合臨床ASF的血清學(xué)快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查，在ASF防控中具有良好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)語(yǔ)

在我國(guó)的《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020）》中，ASF被列為優(yōu)先防范的13種重大外來(lái)動(dòng)物疫病之一，且我國(guó)已發(fā)生首例ASF疫情，該病一旦在我國(guó)廣泛流行，將給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)及養(yǎng)豬相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成巨大沖擊。目前應(yīng)加強(qiáng)流行病學(xué)調(diào)查和主動(dòng)監(jiān)測(cè)排查工作，保持高度警惕，防止該病在我國(guó)的進(jìn)一步流行。本文通過(guò)綜述我國(guó)研究學(xué)者在ASF各種診斷技術(shù)方面取得的研究進(jìn)展以及各種診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為開發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ASFV診斷技術(shù)和診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)，為我國(guó)防控ASFV提供了技術(shù)儲(chǔ)備。相信隨著國(guó)家對(duì)ASF疫情的不斷重視與嚴(yán)防嚴(yán)控力度的不斷加強(qiáng)，研究學(xué)者對(duì)ASF診斷技術(shù)研究的不斷完善，我國(guó)必將能控制和消滅ASFV在我國(guó)的流行。