禽偏肺病毒分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展*

于新友，李天芝

(山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

禽偏肺病毒(Avianmetapneumovirus，aMPV)屬于副黏病毒科、偏肺病毒屬[1]，可感染火雞、雞、雉雞、珍珠雞、鴕鳥等多種禽類，引起禽類呼吸道癥狀、頭部腫脹和產(chǎn)蛋率下降等。火雞鼻氣管炎、禽鼻氣管炎和雞腫頭綜合征等多種疾病都因aMPV感染而發(fā)生，這類疾病也成為禽偏肺病毒病。主要通過水平方式傳播，尚未有垂直傳播的證據(jù)。根據(jù)抗原性和基因特異性，aMPV分為 A型、B型、C型、D型4種型[2]，其中A型、B型在世界范圍廣泛流行，C型、D型在局部地區(qū)流行。各日齡禽類均可感染，4～7周齡發(fā)病率高。該病傳染性強(qiáng)，傳播迅速，病程可持續(xù)2～3周，單獨(dú)感染時僅出現(xiàn)一過性輕微呼吸道癥狀，死亡率不超過5%，當(dāng)混感或繼發(fā)其它疾病時，死亡率可高達(dá)40%[3]，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

1978年，南非共和國首次報道了aMPV引起的火雞鼻氣管炎，并于1989年成功分離到病毒，隨后英國、美國、以色列、法國、日本等國均有報道。1998年我國大陸學(xué)者沈瑞忠首次從腫頭綜合征肉雞中分離了aMPV[5]，目前已證實(shí)aMPV在我國雞群感染率高[6]，包括A型、B型、C型3種血清型。aMPV病毒粒子可呈橢圓形、圓形等多種形狀[7]，直徑大小80～200nm，有囊膜；表面有纖突，長約 13～14nm，不能凝集紅細(xì)胞；對乙醚敏感，不耐熱，56℃ 30min可滅活，pH值為3～9時病毒可保持穩(wěn)定，當(dāng)存在有機(jī)物時，病毒外界抵抗力強(qiáng)，20℃條件下家禽墊料中病毒可存活4周，37℃時可存活長達(dá)2周，常用的消毒劑如過氧乙酸、2%的氫氧化鈉溶液、戊二醛、2%的甲醛溶液均能有效殺滅病毒。aMPV核酸為不分節(jié)段、單股負(fù)鏈RNA，基因組長度約為14kb，共編碼8種結(jié)構(gòu)蛋白，從 3′端到 5′端依次為核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、第二基質(zhì)蛋白（M2）、小疏水蛋白（SH）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）。本文就近年來aMPV的分子核酸探針法、常規(guī)RT-PCR 法、套式RT-PCR法、熒光RT-PCR方法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)等5種生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為禽偏肺病的快速診斷和防控提供參考。

1 核酸探針法

核酸探針是利用核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理，用特異的基因探針與被測定的靶序列互補(bǔ)，以檢測被測靶序列的技術(shù)，可定性或定量檢測特異RNA或DNA序列，它具有操作簡單、結(jié)果易于判定等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層推廣使用。陳琳等[8]根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的B亞型aMPVF基因的保守序列設(shè)計并合成1對引物，利用RT-PCR擴(kuò)增出1條與目的片段大小一致的725bp基因片段，回收、純化PCR產(chǎn)物，用地高辛標(biāo)記，制備出地高辛標(biāo)記的aMPV核酸探針。特異性檢測結(jié)果表明，該探針能與aMPV核酸發(fā)生特異性雜交，而與H9N2亞型 AIV、NDV、IBV、ORT 和 E.coil的核酸雜交反應(yīng)均為陰性，敏感性檢測結(jié)果表明，該探針對aMPV的最低檢出量為5pg。

2 常規(guī)RT-PCR法

RT-PCR是以病毒的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增來檢測病毒的方法，較病毒分離鑒定等傳統(tǒng)的方法的檢測速度更快、靈敏度更高，在動物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。陳琳等[9]根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的B亞型aMPVF基因的保守序列設(shè)計并合成1對引物，利用RT-PCR可以擴(kuò)增出1條725bp的片段，進(jìn)行特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)，建立了aMPV病的RT-PCR檢測方法。特異性試驗(yàn)表明，建立的RTPCR檢測方法能夠從aMPV疫苗毒株VIR115-B中擴(kuò)增到725bp的特異性片段，而對H9N2亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，敏感性試驗(yàn)表明，該方法最低檢出量的cDNA質(zhì)量濃度為1.45μg/L，對山東省492份病料進(jìn)行檢測，陽性檢出率為43.09%(212/492)，隨機(jī)挑取11份進(jìn)行克隆測序及序列分析，結(jié)果顯示所擴(kuò)增到的陽性產(chǎn)物均為B亞型的aMPV。

3 套式RT-PCR法

套式RT-PCR，又稱巢式RT-PCR。采用兩對引物擴(kuò)增目的基因片段，第2對引物在第1對引物的內(nèi)部設(shè)計，以第1對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行再次擴(kuò)增，經(jīng)兩輪擴(kuò)增，保證的擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，提高了PCR檢測的敏感性。薛聰?shù)萚10]根據(jù)GenBank發(fā)布的B亞型aMPVF基因的保守序列設(shè)計2對引物，建立了一種適用于B亞型aMPV的逆轉(zhuǎn)錄套式PCR檢測方法。此方法具有高度特異性和敏感性，以H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。經(jīng)檢測，該方法第1次 PCR擴(kuò)增的敏感性為107copies/μl，第2次擴(kuò)增的敏感性為102copies/μl，第2次擴(kuò)增敏感性比第1次高105倍。

4 熒光RT-PCR方法

熒光RT-PCR是在常規(guī)RT-PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，檢測速度快、敏感高，可直接觀察擴(kuò)增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，減少了對環(huán)境氣溶膠污染的可能，避免了假陽性結(jié)果。據(jù)信號基團(tuán)的不同，實(shí)時熒光定量 PCR可以分為染料法和探針法兩種。王麗榮等[11]根據(jù)GenBank登錄的B亞型aMPVF基因序列設(shè)計1對特異性引物，建立SYBRGreenⅠ熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，并做敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，產(chǎn)物 T值在 83.0～83.7℃之間，靈敏度為 7.9×102拷貝/μl，特異性和重復(fù)性較好。劉佳佳等[12]根據(jù)GenBank中C型aMPVP基因序列，設(shè)計出一對特異性引物和Taqman探針，建立了C型aMPV Taqman探針熒光定量PCR方法。結(jié)果表明，該方法只對C型aMPV檢測為陽性，具有良好的特異性，能夠檢測到(3.63×102)拷貝數(shù)，具有良好的敏感性，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.312，截距為44.66，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，循環(huán)閾值和模板拷貝數(shù)具有良好的相關(guān)性，組內(nèi)及組間重復(fù)性好。陳基明等[13]根據(jù)GenBank發(fā)表的aMPVF基因序列，設(shè)計一對特異性引物，建立C亞型aMPV的SYBR GreenⅠ實(shí)時熒光定量PCR方法。對該反應(yīng)體系進(jìn)行條件優(yōu)化，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行特異性、敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)，然后將建立的方法應(yīng)用于臨床樣品和攻毒樣品的檢測。結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，建立的方法只能檢測出C亞型aMPV，最低可以檢測到0.8×101拷貝/μl的核酸模板，重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于4%。應(yīng)用建立的方法對43份臨床樣品檢測，結(jié)果顯示均為陰性，對42份35日齡SPF雞人工感染后1～21d的氣管和肺臟樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示攻毒樣品均為陽性。

5 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增 (LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果可通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，具有靈敏度高、操作簡單、反應(yīng)時間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優(yōu)點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。鞠小軍等[14]針對B亞型aMPVF基因的特異性引物，并從反應(yīng)時間、溫度、各組分濃度等方面優(yōu)化了反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了B亞型aMPV逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增 (RT-LAMP)快速檢測方法。該方法能夠在63℃條件下1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)B亞型aMPVF基因片段的特異性擴(kuò)增，與其他病毒，如H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)等的核酸無交叉反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果可直接用肉眼判斷。對質(zhì)粒DNA的最小檢測量為1×102拷貝/μl。

6 小結(jié)

疾病的正確診斷是進(jìn)行有效防控的前提和基礎(chǔ)，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，臨床上的禽病變得越來越復(fù)雜，老病新發(fā)和疾病混感現(xiàn)象增加，很難通過臨床表現(xiàn)和眼觀病變診斷疾病，需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行精準(zhǔn)診斷，從而及時采取有效的措施，降低損失。aMPV病雖然在火雞上存在幾十年了，也是對火雞危害最嚴(yán)重的幾種疾病之一，但在雞上的研究并不多，主要引起雞腫頭綜合征和減蛋下降，近年來引起關(guān)注。由于病毒分離培養(yǎng)難度大，血清學(xué)診斷不能判定是否現(xiàn)癥感染，且易混感其它疾病的特點(diǎn)，更增加了疾病的診斷難度，當(dāng)前主要依靠分子生物診斷進(jìn)行確診，雖然aMPV分子生物學(xué)檢測方法多樣，但各有利弊，常規(guī)RT-PCR方法雖然檢測速度快、特異性強(qiáng)，但不能定量，且檢測敏感性不高。熒光RT-PCR方法雖然克服了常規(guī)RT-PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價格昂貴，檢測成本比較高，不適合基層應(yīng)用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進(jìn)行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了免核酸提取熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)、便攜式熒光PCR儀器及除模板外PCR組份凍干保存技術(shù)，如能應(yīng)用于aMPV分子檢測，必將開發(fā)出更方便、快捷、成本更低的病毒分子檢測技術(shù)，方面疾病快速確診，從而更好做好禽偏肺病毒病的防控工作。針對該病尚無有效的治療方法，國內(nèi)也無疫苗預(yù)防，確診后只能對癥治療，從生物安全方面進(jìn)行控制，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高禽類機(jī)體抗病力。禽舍定期通風(fēng)、降低氨氣濃度、減少飼養(yǎng)密度、減少應(yīng)激以降低禽偏肺病毒發(fā)病率和病情的嚴(yán)重程度。