過量銅脅迫對柑橘影響的研究進展（2）

鄭重祿

（福建省泉州市洛江區(qū)農(nóng)業(yè)水務局 泉州362011）

編者按：隨著含銅化肥和農(nóng)藥，污水灌溉、污泥和畜禽糞便的長期大量使用及工業(yè)“三廢”排放量的增多，增加了土壤中的銅（Cu）含量，植物銅中毒的現(xiàn)象越來越普遍。本文主要綜述了柑橘對銅毒害的反應、過量銅對柑橘細胞超微結(jié)構(gòu)、酶活性、光合作用和銅過量與其他元素的吸收影響等，從而為更深入的研究柑橘銅中毒的機理，合理調(diào)控果園土壤銅的生物效應，防止銅的污染，指導平衡施肥提供一定的參考。由于文字較多，分期連載。

1.3 柑橘銅的吸收、分配及葉、根含量狀況

植物對銅的吸收是一種主動吸收的過程，銅被根系吸收后通過銅轉(zhuǎn)運蛋白運輸至植物的其他器官，銅在不同器官的積累規(guī)律由大到小依次為根系、枝干、新梢、葉片。銅在柑橘中的分布累積具有劑量-效應關系和組織器官差異性。這種差異既存在于不同的器官或組織，也存在于不同的細胞或細胞的不同部位。銅在細胞壁中含量高，細胞膜內(nèi)部含量低，銅的移動主要通過細胞間隙。黎耿碧等[31]研究發(fā)現(xiàn)，柑橘對銅的吸收均隨Cu2+濃度的增加而呈線性增加，根系銅的積累大于枝葉銅的積累，但柑橘的生長量和銅的轉(zhuǎn)移率下降。這說明，柑橘在銅含量高時根系能將銅沉積富集在根部，以根部為最高，向地上部輸送較少。

銅在同種柑橘的不同部位的分布不同。黃玉溢等[1]研究發(fā)現(xiàn)，廣西柑橘葉片銅含量比側(cè)根銅含量少。葉片銅含量在0.90～42.20mg/kg之間，平均為8.78mg/kg，變異系數(shù)為94.16%，而側(cè)根銅含量在5.00～50.50mg/kg之間，平均為15.76mg/kg，變異系數(shù)為64.39%；不同樹齡側(cè)根及葉片的銅含量亦有差異。側(cè)根和葉片的銅含量隨樹齡的增長而增加，這與耕作層土壤有效銅含量的分布規(guī)律一致。

過量銅脅迫時，柑橘根部對銅的積累遠大于葉片，葉片中銅含量隨著處理銅濃度的增加而增加，但銅從根部向葉片的轉(zhuǎn)移率顯著下降[29]。達到一定上限值后，即使增加外界銅濃度，葉片銅含量也不再增加[32]。

柑橘側(cè)根及葉片和果實的銅含量與柑橘園耕作層土壤有效銅之間密切相關，其中側(cè)根、葉片銅含量與土壤有效銅含量之間存在極顯著正相關；側(cè)根銅含量與葉片銅含量之間呈顯著正相關[18，33，34]。柑橘葉片銅含量與土壤有機質(zhì)含量呈正相關，與土壤pH值呈負相關[10]。柑橘果實銅含量與土壤中有效銅含量呈正相關，與葉片的銅含量呈正相關[35，36]。這說明，柑橘銅富集量主要來源于土壤的有效含量，與土壤銅含量呈正相關。

銅在柑橘樹體內(nèi)的分布并不均勻。不同柑橘品種及其樹體不同部位、不同器官或組織的銅含量存在較大的差異。柑橘不同器官對土壤銅的吸收富集能力(富集系數(shù))的差異大于同一器官的不同組織。以香橙做砧木，樹體中的銅含量低于枳砧對照，而紅橘做砧木，樹體中的銅含量比枳砧對照高[37]。

銅在柑橘葉片中的分布是均勻的，葉綠體中含銅量比較高，線粒體中也含有銅；而莖干和老熟葉片中較少[14]。贛南臍橙葉片銅含量，在不同果園之間變化大；土壤類型對葉片銅含量無影響[38]，這可能與銅的來源有關。不用銅制劑的果園則銅含量相對缺乏或不足。湖北椪柑、臍橙和溫州蜜柑葉片銅含量以溫州蜜柑葉片最高。就同一柑橘種類而言，葉片銅含量變異性較大，溫州蜜柑葉片銅含量與土壤有效銅含量呈正相關[14]。這說明，柑橘葉片銅含量受土壤中銅有效性的直接影響。

紫色丘陵地錦橙與夏橙果肉、果皮、葉片銅含量的總體趨勢是葉片＞果皮＞果肉；錦橙葉片對土壤銅的富集能力顯著大于夏橙葉片，但錦橙和夏橙的果皮、果肉與土壤銅的富集能力差異不顯著[39]。而湖北宜昌溫州蜜柑、清家臍橙和四季柚果肉銅含量高于果皮[40～42]。由此可見，柑橘果肉、果皮、葉片銅的富集量與土壤銅的含量呈正相關即土壤中銅的含量越高，柑橘果肉、果皮、葉片銅的富集量也越高。

2 過量銅對柑橘的毒害效應

2.1 柑橘銅中毒的癥狀表現(xiàn)

土壤中銅含量超過50mg/kg時，柑橘幼苗生長受影響；葉片中銅正常含量為5～16mg/kg，超17mg/kg為過量[43]。黎耿碧等[31]通過水培發(fā)現(xiàn)，‘印度酸橘’、‘施文格枳柚’小苗在銅離子濃度≥0.1μmol/L時生長受到抑制；Reuther W和Smith P F[29]研究發(fā)現(xiàn)，佛羅里達州酸性沙質(zhì)土壤銅含量為320～372kg/hm2時，柑橘葉片出現(xiàn)失綠，須根死亡，根系色深短粗。

柑橘銅中毒時往往伴隨生長受阻和失綠癥。柑橘銅毒害外部癥狀十分明顯，表現(xiàn)為新葉失綠黃化，老葉壞死，葉柄和葉背面有時呈現(xiàn)紫紅色，樹皮開裂和樹干流膠、落葉；反復噴施波爾多液會使柑橘生長減緩，出現(xiàn)部分早期異常落葉[14，43～45]。從外部特征看，柑橘銅中毒的癥狀與缺鐵相似，出現(xiàn)葉片黃化，葉面噴施鐵肥或螯合態(tài)鐵可減輕失綠癥。這可能是由于銅過多時會引起銅從生理重要中心置換出其它的金屬離子(如鐵等)。

據(jù)報道，化工廠氯化氫氣體泄漏后與空氣中的水汽結(jié)合形成酸霧，酸霧會與柑橘園剛噴過含銅殺菌劑波爾多液中的堿中和，激活銅離子（Cu2+），葉片過量吸收Cu2+后就會出現(xiàn)毒害癥狀，即葉片葉脈木質(zhì)化，葉面呈褐色焦斑直至全褐，葉片脫落（葉柄留樹），嚴重者新梢基本脫落[43]。另外，噴施波爾多液后，藥液未干即遇降雨，或在葉片上露水未干時噴藥，由于銅的離解度及葉片滲透能力變化，會使葉面上的可溶性銅含量驟然增加而使葉片灼傷等。

莊伊美等報道在紅壤蕉柑和椪柑園出現(xiàn)葉片黃化，早期落葉等癥狀，其原因便是銅含量高，為正常量的2～3倍[46]。Reuther和Smith 觀察到美國佛州酸性沙壤土(pH≤5.O)上種植的柑橘葉片易出現(xiàn)缺鐵性黃化，被認為是由于銅中毒引起的[29]。

銅中毒首先表現(xiàn)在柑橘根部最易受到毒害，通常表現(xiàn)為新根生長受抑制，伸長受阻而畸形，側(cè)根數(shù)量減少，嚴重時根尖枯死[43]。過量的銅還引起須根腐爛。可見，銅可以影響細胞有絲分裂，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)受損，從而導致根內(nèi)大量物質(zhì)外溢。此外，過量的銅引起落葉、落果，促進乙稀合成及生長不活性化。因此，銅毒被認為是引起落葉落果的主要原因[47]。

2.2 銅毒害對柑橘細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

過量銅脅迫使植物在細胞、組織和器官水平上的結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。銅與細胞壁具有高度親和力，大部分以離子形式吸附結(jié)合到果膠、纖維素、木質(zhì)素等上[48]。過量銅對細胞的破壞非常明顯，細胞膜破裂，質(zhì)壁發(fā)生分離，部分細胞細胞壁發(fā)生溶解狀斷裂，胞質(zhì)在細胞間的流動加劇，破壞了細胞間正常的物質(zhì)及信息傳遞。

根系是銅直接接觸的部位，過量銅首先對柑橘根尖細胞壁、細胞膜結(jié)構(gòu)透性等造成傷害。導致根系細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。銅毒害下根細胞結(jié)構(gòu)完整性受到破壞，皮層細胞、中柱細胞液泡化，細胞質(zhì)出現(xiàn)淀粉粒，細胞器受到嚴重損傷，細胞核染色質(zhì)密度增大，核仁縮小[49]。Doncheva等[50]研究發(fā)現(xiàn)，50mol/L Cu2+處理情況下，柑橘砧木小苗根尖細胞受到極大損傷，根尖細胞的細胞壁變薄、彎曲，胞間層降解，線粒體膜降解，細胞質(zhì)中出現(xiàn)淀粉粒。

張國軍[51]研究表明，在5μmol/L Cu2+處理下，柑橘根系細胞質(zhì)收縮，細胞壁略有降解，發(fā)生質(zhì)壁分離；線粒體嵴消失，核膜局部破裂，核仁消失。當Cu2+濃度＞20μmol/L時，柑橘根尖細胞壁降解，變薄，細胞間距變小；導管壁變薄，髓部變黑，木栓化嚴重，木質(zhì)部變黑，維管束排列雜亂；核膜和線粒體膜破裂，液泡破裂，線粒體數(shù)量減少甚至解體；淀粉粒隨Cu2+濃度的增加而減少。40μmol/L Cu2+處理下，柑橘根系細胞間隙變小，部分細胞壁降解，線粒體消失，細胞內(nèi)物質(zhì)溶解，植株已接近死亡。由此可見，銅毒害使柑橘根系逐漸變黑，根尖變粗變短，中柱和皮層細胞壁變薄，根尖細胞間距變小，細胞壁彈性變小，僵硬度增加；線粒體數(shù)量減少；膜系統(tǒng)被破壞，核膜線粒體膜破裂；細胞中淀粉粒明顯減少，甚至消失；嚴重時發(fā)生細胞溶解。

過量銅脅迫造成柑橘葉片細胞超微結(jié)構(gòu)的破壞。最明顯的變化是葉片細胞質(zhì)膜和細胞器(包括葉綠體、液泡和線粒體等)的膜系統(tǒng)的受損。這也許就是葉綠體對銅敏感的原因。張國軍[51]研究發(fā)現(xiàn)，當Cu2+濃度為5μmol/L 時就已經(jīng)對柑橘葉片葉綠體產(chǎn)生傷害，表現(xiàn)為葉綠體變形，葉綠體膜消失，基粒片層扭曲，分布混亂，嚴重時，葉綠體與細胞質(zhì)混在一起；20μmol/L Cu2+處理時，柑橘葉片表面細胞凹凸不平，氣孔填塞或者關閉；細胞間隙變小，細胞質(zhì)濃縮，細胞明顯發(fā)生質(zhì)壁分離，且細胞壁降解；液泡膜破裂，液泡消失。淀粉粒減少甚至消失；線粒體變形，線粒體膜局部破裂，嵴數(shù)量明顯減少且結(jié)構(gòu)模糊；當Cu2+濃度達到40μmol/L時，細胞壁局部降解甚至破裂，細胞壁細胞器完全溶在一起，線粒體消失，葉綠體溶解；嚴重時，導致細胞溶解。

2.3 銅毒害對柑橘生物量的影響

2.3.1 銅毒害對柑橘生長的影響

過量銅脅迫對柑橘毒害效應的表現(xiàn)之一是抑制地上部生長，葉片發(fā)生黃化，進而影響產(chǎn)量。在美國佛州，當土壤的含銅量超過50mg/kg時，柑橘幼苗生長受到影響,減慢柑橘種子的發(fā)芽速率，延緩實生苗的生長等[29]。過量銅脅迫下柑橘樹冠容積、干粗減小，還可引起柑橘大量落葉，枝梢枯萎，甚至全樹死亡[44]。土培試驗的柑橘小苗品種CM和SC 的生長量都明顯地隨著營養(yǎng)液中銅離子（Cu2+）濃度的增加而呈線性下降，大于0.1 μmol/L 就明顯抑制柑橘小苗的生長[31]。張國軍[51]研究發(fā)現(xiàn)，0.1μmol/L Cu2+處理對柑橘苗木的毒害不明顯，且對生長有一定的促進作用，與對照相比，葉片濃綠，株高及葉片干、鮮重均有所增加；隨著Cu2+處理濃度的逐漸增大，當Cu2+濃度為5μmol/L時就已經(jīng)產(chǎn)生了毒害，葉量變少，葉面積變小，葉生物量降低，生長明顯受到抑制。且隨著濃度的增加毒害作用逐漸加深，20μmol/L Cu2+處理在15d后嫩芽枯死，葉尖失綠黃化，老葉有部分凋謝。40μmol/L Cu2+處理，7d后葉片開始萎蔫，新葉葉尖失綠黃化，老葉開始脫落嫩芽枯萎。Cu 脅迫還導致柑橘苗木葉、莖水分代謝紊亂，葉、莖吸收水分的能力明顯減弱。銅對莖毒害的影響相對比葉小，這與Cu對其他植物的毒害研究相似[52]。

2.3.2 銅毒害對柑橘根系的影響

已有研究表明，外源銅進入土壤后，通過柑橘根系吸收進入根細胞內(nèi)積累，與細胞膜蛋白的活性位點結(jié)合，并隨著蛋白質(zhì)大分子轉(zhuǎn)運到地上部。銅通常在細胞壁和細胞膜的非原生質(zhì)部分累積，從而阻止了銅進入胞液及向地上部分的轉(zhuǎn)運[53]。根系是銅被植物吸收的最初位點，銅毒害首先是根系，最嚴重的也是根系。銅幾乎被吸收的瞬間就影響根的伸長，伴隨著細胞分裂能力的銳減和頂端分生組織核酸的破壞。過量銅影響根系細胞伸長和分化，且在伸長區(qū)和分生區(qū)檢測到更高的生長素活性，說明過量銅引起了生長素的再分配，進而抑制根系細胞增殖[54]。有研究認為，細胞伸展對銅毒害比細胞分化表現(xiàn)得更為敏感[55]。

過量的銅抑制脫羧酶的活性，間接阻礙NH4+向谷氨酸轉(zhuǎn)化，造成NH4+的累積，使根部受到嚴重損傷。同時銅使分生區(qū)細胞核變小，核仁變小，阻滯了其分裂[56]，使之不能發(fā)揮正常的吸收與輸送養(yǎng)分和水分的功能。土壤中過量的有效態(tài)銅會影響土壤中微生物環(huán)境，微生物量減少，種群結(jié)構(gòu)受到破壞[57]；土壤中的酶活性，如土壤脲酶、硝酸還原酶等也會受到明顯抑制[58]。過量的銅對柑橘叢生菌根有著類似殺菌劑的效應，抑制了叢生菌根的侵染率和柑橘根系的功能和生長發(fā)育，從而導致了柑橘缺磷和缺鐵癥狀[59]。

張國軍[51]研究發(fā)現(xiàn)，0.1μmol/L Cu2+處理柑橘苗，其根鮮重、平均根長均略有增加，但與對照差異不顯著。但當Cu2+濃度為5μ mol/L 時就已經(jīng)產(chǎn)生了毒害，根系長度、側(cè)根數(shù)量和根系生長范圍均受到抑制，且隨著濃度的增加毒害作用逐漸加深，根含水量明顯下降，與對照差異達極顯著。脅迫20d后，根系生長明顯受阻，無新根產(chǎn)生，50d后根尖腐爛，側(cè)根、根毛減少。由此可見，在低銅情況下，柑橘苗的中毒反應不明顯，高銅脅迫下柑橘苗現(xiàn)出強烈的中毒現(xiàn)象，且對地下部的傷害大于地上部。

2.3.3 銅毒害對柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

銅是柑橘多種蛋白質(zhì)和酶的組成成分，影響碳水化合物、脂肪和氮的代謝，對植株的發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響。一些供給外源銅的試驗表明，銅含量顯著影響花器官發(fā)育。高濃度銅會抑制柑橘花粉萌發(fā)和花粉管伸長。柑橘葉片銅含量顯著影響柑橘產(chǎn)量，柑橘果實產(chǎn)量(y)與葉片含銅量(x)間存在二次函數(shù)關系y＝-0.6859X2＋15.392x-48.173（r=O.8991**，n=7)[14]。

由于高濃度銅抑制根系生長，降低根系活力，使葉綠素含量降低，導致養(yǎng)分吸收減少，光合速率降低，因而明顯降低植株產(chǎn)量和品質(zhì)。銅的毒性水平僅略高于正常水平[60]，輕微的銅中毒就會導致柑橘的品質(zhì)下降。隨土壤有效銅含量增加，琯溪蜜柚果實?；潭燃又豙61]。過量銅可使柑橘樹的果數(shù)減少[28]，反復噴施波爾多液可使柑橘果實變小，產(chǎn)量降低[44]。

楊生權(quán)[10]研究發(fā)現(xiàn)，重慶忠縣柑橘葉片銅含量與果實品質(zhì)大多數(shù)指標呈負相關。馬家柚單果質(zhì)量和果皮厚度均與果實中的銅呈負相關[62]。南豐蜜橘果實化渣品質(zhì)因子與葉片銅含量有著密切的聯(lián)系，果肉瓤瓣剪切力與葉片銅含量呈顯著負相關；果肉瓤瓣剪切功與葉片銅含量呈二次函數(shù)關系，當銅含量大于35mg/kg時，果肉瓤瓣剪切功隨著銅含量的增加而升高；果實維生素C（Vc）隨著葉片銅的增加而降低；果實單果重與葉片銅含量呈顯著負相關[63]。溫州蜜柑葉片銅含量與果實“酸化”有關，果實固酸比與土壤有效銅和葉片銅均呈顯著負相關[40]?？傊?，土壤中過量的銅使果實中銅含量增加，對柑橘產(chǎn)生明顯的毒害，通過一系列生物化學過程及代謝過程的紊亂表現(xiàn)，并最終導致柑橘的生物產(chǎn)量和經(jīng)濟產(chǎn)量明顯降低。

2.4 銅毒害對不同柑橘砧木的影響

Chundawat等[64]對不同柑橘砧穗組合植株組織中的微量元素進行分析，發(fā)現(xiàn)6種砧木對葉片銅含量的影響不顯著，而在接穗和不同砧穗組合影響下變化顯著。在‘Sathgudi甜橙’上的研究結(jié)果與之相似，砧木在微量元素的吸收方面無顯著差異。Alva等[29]研究發(fā)現(xiàn)，耐銅性較強的‘印度酸橘’在銅過量情況下，對微量元素的吸收下降幅度小于‘施文格枳柚’，枝葉中銅含量顯著低于‘施文格枳柚’。用含200mg/kg Cu2+的土壤對‘粗檸檬’與‘印度酸橘’進行處理，發(fā)現(xiàn)根系生長都受到影響，但‘粗檸檬’枝梢的生長量受影響程度輕于‘印度酸橘’，同時‘粗檸檬’根系的銅含量比‘印度酸橘’少45%[65]。

另有研究發(fā)現(xiàn)，‘施文格枳柚’砧夏橙（SW）在正常情況下，葉片銅含量比酸橘砧夏橙（SM）高，但在過量銅情況下無顯著差異；銅過量情況下，SW葉綠素值較SM下降更多，但在根尖顯微結(jié)構(gòu)中，SM 胞間層受損呈碎片狀，細胞壁也受到嚴重破壞，而SW細胞結(jié)構(gòu)相對更完整[66]。Hippler F R等[67]研究發(fā)現(xiàn)，‘施文格枳柚’砧甜橙（SW）在0.015～0.6 μmol/L 銅濃度期間新梢干質(zhì)量增長45%，0.6～24μmol/L 銅濃度新梢干質(zhì)量下降16%，而萊檬砧甜橙（RL）新梢分別增長23%，下降46%；RL 受到脅迫后葉面積較SW下降得更多，MnSOD、Fe-SOD 抗氧化酶活性更低，表明RL 在銅過量時忍耐性不如SW。