精準(zhǔn)醫(yī)療理念下宮頸癌治療相關(guān)基因研究進(jìn)展

王微 張杰 孫鳳春 徐兆凱

作者單位：255314 山東淄博，齊魯醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生系（王微、張杰、孫鳳春）；山東新華安得醫(yī)療用品有限公司（徐兆凱）

高危型人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）亞型的生殖道感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的必要條件，在世界范圍婦女中，宮頸癌（Cervical cancer，CC）是最常見的惡性腫瘤之一[1]。致癌HPV亞型的持續(xù)性感染是引發(fā)宮頸癌的因素之一，其中HPV16、HPV18型與宮頸癌發(fā)病的關(guān)系最為密切[2]，HPV16感染主要導(dǎo)致宮頸鱗癌，HPV18感染主要導(dǎo)致宮頸腺癌[3]。近年來，宮頸癌發(fā)病率逐漸上升，患者的年齡也呈年輕化趨勢，研究能夠特異性抑制宮頸癌發(fā)生發(fā)展的手段非常必要[4，5]。傳統(tǒng)宮頸癌的臨床治療主要以手術(shù)、化療、放療等為主，其中手術(shù)治療針對早期患者，晚期患者采用放化療的治療方法，復(fù)發(fā)患者的臨床治療效果較差。對于晚期不適合進(jìn)行手術(shù)以及對放化療不敏感的患者，治療后的五年生存率并不理想。一直以來，研究者們致力于研究發(fā)現(xiàn)新的微創(chuàng)、副反應(yīng)小、可以根治癌癥的方法。隨著醫(yī)學(xué)與多學(xué)科的交叉滲透發(fā)展，尤其是“精準(zhǔn)醫(yī)療”概念的提出，人們正研究利用分子生物學(xué)技術(shù)在基因水平對其進(jìn)行治療。本研究主要圍繞精準(zhǔn)醫(yī)療的概念及技術(shù)，對其在宮頸癌領(lǐng)域的治療進(jìn)行綜述。

1 精準(zhǔn)醫(yī)療計劃與腫瘤

2015年1月20日，美國總統(tǒng)奧巴馬在國情咨 文 中提出“精準(zhǔn) 醫(yī) 療 計劃 (precision medicine initiative)”[6]?！熬珳?zhǔn)醫(yī)療”作為一種新興的醫(yī)療模式，是指在患者基因組信息的基礎(chǔ)之上，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等相關(guān)信息，針對患者自身基因特點(diǎn)而制定出的最適治療方案。在這種方案下，治療的策略、實施等都是以誘發(fā)疾病發(fā)生的基因為基礎(chǔ)，這種方案有別于傳統(tǒng)的根據(jù)患者癥狀和體征定制的治療方案[7]。精準(zhǔn)醫(yī)療是以個體化醫(yī)療為基礎(chǔ)，通過檢測與疾病相關(guān)的特定生物學(xué)標(biāo)志物，再根據(jù)患者的自身病史等情況，對患者制定出最優(yōu)的治療方案。精準(zhǔn)醫(yī)療的概念是個體化醫(yī)療的延伸，是基于一組病患或人群，而不僅僅考慮個體本身的差異，更偏向于針對患有特定疾病的、有著某些相同遺傳信息的人群，既大量患者中少量特定的人群，這些人群在分子層水平上有一致的致病原因，這就為精準(zhǔn)醫(yī)療的研究提供了依據(jù)。隨著近年來人類基因組測序、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因組學(xué)等大數(shù)據(jù)技術(shù)的飛速發(fā)展，這一概念的應(yīng)用領(lǐng)域更為廣泛[7]。

精準(zhǔn)醫(yī)療適用于醫(yī)學(xué)各個學(xué)科，但由于各種原因，腫瘤學(xué)科是精準(zhǔn)醫(yī)療的最佳應(yīng)用領(lǐng)域之一。在我國，癌癥的發(fā)生率逐年上升，并且已成為第一死因。傳統(tǒng)的癌癥治療方法如手術(shù)切除、化療、放療等，是以單一的“破壞性”治療為主，這些方法在一定程度上給腫瘤患者減輕痛苦的同時，也存在著治療毒副作用等弊端，如手術(shù)切除給患者造成的創(chuàng)傷巨大、全身化療和放療特異性較差，會同時對正常細(xì)胞有殺傷作用，以及其較大的毒性作用破壞免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致患者的生存質(zhì)量不理想[8]。隨著醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，尤其是伴隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對腫瘤分子病理基礎(chǔ)研究的深入，腫瘤研究已經(jīng)從細(xì)胞生物學(xué)水平，逐漸擴(kuò)展到分子生物學(xué)水平。腫瘤的發(fā)生與多種因素有關(guān)，并且是多步驟發(fā)展的全身性、系統(tǒng)性疾病，不僅與環(huán)境因素有關(guān)，基因組的異常改變?nèi)绨┗颉⒁职┗虻娜笔蛔兓蚧虮磉_(dá)調(diào)控異常是導(dǎo)致腫瘤無限生長與轉(zhuǎn)移的主要原因。每個腫瘤都與特定癌基因的突變和相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的失常相關(guān)聯(lián)，而這些信息是用來確定藥物或基因治療靶點(diǎn)的基礎(chǔ)。因此，我們可以從分子水平發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生的共性，這對腫瘤的治療尤為重要。

2 RNA 干擾在宮頸癌治療中的應(yīng)用

致癌型 HPV 亞型（如 HPV16、18、52）是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要元兇，病毒在人體持續(xù)感染的過程中與宮頸細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生整合，使正常細(xì)胞發(fā)生癌變，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。高危型病毒的致癌基因是E6/E7基因，其編碼E6/E7蛋白[9]。HPV16型病毒的E6和E7基因轉(zhuǎn)錄，是由一個共同啟動子（p95）引導(dǎo)的，E6基因編碼的蛋白與p53特異性結(jié)合后通過泛素化途徑誘導(dǎo)p53的降解。而p53作為一種抑癌基因產(chǎn)物，可以促使癌細(xì)胞因DNA損傷而凋亡，E6蛋白與p53的結(jié)合可以阻斷這一機(jī)制，從而抑制癌變細(xì)胞的凋亡[10]。E7蛋白與pRb的結(jié)合導(dǎo)致pRb發(fā)生高磷酸化，釋放出的核轉(zhuǎn)錄因子E2F誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S期，從而使上皮細(xì)胞因繞過正常細(xì)胞周期檢測點(diǎn)而發(fā)生無限增殖[11]。RNA干擾技術(shù)可以誘導(dǎo)相關(guān)基因發(fā)生沉默從而使其失去表達(dá)功能，其原理是細(xì)胞內(nèi)的核酸酶III-Dier將導(dǎo)入細(xì)胞的外源或內(nèi)源性雙鏈RNA處理為21～23bp的小干擾RNA(siRNA)，siRNA再結(jié)合解螺旋酶、核酸酶等形成一種RNA沉默復(fù)合物，該復(fù)合物與特定基因的mRNA結(jié)合后將這段mRNA降解[12]。

Hong等[13]利用該技術(shù)，設(shè)計了HPV16基因啟動子p95區(qū)的siRNA，將該siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞從而進(jìn)行癌基因沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SiHa細(xì)胞中E6、E7mRNA的表達(dá)量分別降低了45.2%和41.7%；E6、E7蛋白的表達(dá)量分別降低了33.3%和30.3%；癌細(xì)胞的生長和增殖受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率明顯增加。石華等[14]同時研究HPV16E6、siRNA與hIL-24基因聯(lián)合誘導(dǎo)人宮頸癌CaSki細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)HPVE6癌基因的mRNA水平下降明顯，抑癌蛋白p53水平增高，細(xì)胞凋亡率明顯升高，說明HPV16E6siRNA能抑制CaSki細(xì)胞中HPV-16E6癌基因的表達(dá)，使抑癌蛋白p53恢復(fù)活性，誘導(dǎo)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡。徐永芳等[15]通過體外脂質(zhì)體介導(dǎo)的VEGFsiRNA1、2、3號鏈轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞株。VEGF是一種與血管形成和血管通透性有關(guān)的誘導(dǎo)因子，可以由不同腫瘤細(xì)胞分泌，也可在發(fā)育正常細(xì)胞及組織中表達(dá)，其作用是促進(jìn)腫瘤血管生成，對腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后均具有重要意義，是治療腫瘤血管生成的重要靶向。研究發(fā)現(xiàn)VEGFsiRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞株可使細(xì)胞中VEGFmRNA表達(dá)量降低，并且不同的siRNA下調(diào)mRNA效率不同。

3 microRNA 在宮頸癌治療中的研究

microRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，長約18～21個核苷酸?？梢耘c靶mRNA序列的3'端非翻譯區(qū)堿基互補(bǔ)配，降解這段靶mRNA或抑制其翻譯，屬于轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[16]。microRNA對基因的表達(dá)抑制作用已經(jīng)在一些研究中得到證實，大量的microRNA的靶基因是抑癌基因或癌基因，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)參與癌癥的發(fā)生，microRNA能夠識別特定目標(biāo)的mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯，在細(xì)胞癌變的過程中起到重要的作用。因此，microRNA被認(rèn)為可以參與廣泛的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞凋亡與增殖、細(xì)胞分化、腫瘤的生長調(diào)控及形成等過程[17]。microRNA比較穩(wěn)定，可以從細(xì)胞株中提取，也可以從各種類型的臨床標(biāo)本中獲得，如冷凍標(biāo)本，石蠟包埋組織、血液、尿液等體液中?；谝陨显?，微小RNA在引起腫瘤發(fā)生的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用，并且有望用于宮頸癌的臨床診斷和治療中。

大量研究顯示，microRNA在宮頸癌的發(fā)病中起到重要的作用。miR-143和miR-145可以抑制宮頸癌細(xì)胞生長，而miR-146a對細(xì)胞增殖擴(kuò)散有促進(jìn)作用[18]。Li等[19]研究了與宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-29與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，它可以通過抑制細(xì)胞周期循環(huán)從而抑制癌癥的發(fā)生。同時，由于YY1、CDK6與癌基因E6/E7的表達(dá)成正相關(guān)，miR-29可以通過靶向作用YY1與CDK6抑制癌基因的表達(dá)，從而抑制宮頸癌的發(fā)生。miRNA啟動子的異常甲基化是某些miRNA基因與癌基因或抑癌基因功能發(fā)生改變的原因之一，有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA基因甲基化狀態(tài)的改變可以使宮頸癌中miRNA表達(dá)受到抑制作用。miRNA基因的甲基化狀態(tài)可以通過甲基化PCR、亞硫酸鹽修飾法或焦磷酸測序進(jìn)行分析，有研究[20]以HPV感染的宮頸細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)miR-432、miR-1286、miR-641、miR-1290、miR-1287和 miR-95表達(dá)高甲基化。其他研究中也發(fā)現(xiàn)在高級別宮頸病變中，miR-149、miR-203和miR-375的高甲基化，同時發(fā)現(xiàn)miR-203和miR-375可能作為宮頸癌前病變的標(biāo)志物[21]。以上研究說明，一些miRNA在宮頸癌中顯示出不同的甲基化變化，并且不同miRNA的甲基化聯(lián)合分析可能最適合于診斷宮頸病變的發(fā)生。

4 LncRNA 與宮頸癌的相關(guān)性研究

根據(jù)高通量基因組轉(zhuǎn)錄分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)人類基因組中有20 000多個基因可以編碼蛋白，大約占整個基因組的2%[22]，其余的基因則被轉(zhuǎn)錄成或長或短的不能編碼蛋白的RNA（非編碼RNA）。長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA，LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200bp的大分子RNA，其特點(diǎn)是不編碼蛋白，但表達(dá)具有明顯的組織器官特異性，廣泛分布于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。LncRNAs一般由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，有時也經(jīng)過剪接加工，具有帽子及polyA尾結(jié)構(gòu)，但其由于缺少開放閱讀框而不具有編碼蛋白質(zhì)的能力。近年來發(fā)現(xiàn)，LncRNA參與多種基因表達(dá)調(diào)控過程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄前或表觀遺傳學(xué)調(diào)控[23]。這些由LncRNA參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可影響癌癥或其他疾病的發(fā)生。與小非編碼RNA（如miRNA）相比，LncRNA的生物學(xué)功能還遠(yuǎn)未被發(fā)現(xiàn)，然而一些研究發(fā)現(xiàn)了LncRNA的調(diào)控作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)移等[24]。腫瘤細(xì)胞中某些特定的LncRNA表達(dá)量發(fā)生變化，這些特異型LncRNA的表達(dá)情況可作為腫瘤診斷指標(biāo)和治療的分子靶點(diǎn)，因此推測LncRNA也將是腫瘤研究的新方向。

近年來，LncRNA與宮頸癌的發(fā)生成為研究熱點(diǎn)之一，與宮頸癌發(fā)生相關(guān)的LncRNA也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Hoppe-Seyler等[25]發(fā)現(xiàn)僅高危型HPV感染不足以導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，通過研究推測LncRNA可能通過改變病毒轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)致癌靶基因E6/E7表達(dá)過程，從而促進(jìn)癌變發(fā)生。LncRNACRNDE是2011年發(fā)現(xiàn)的與結(jié)直腸腫瘤相關(guān)的基因，因其較低的編碼蛋白質(zhì)能力，被歸類為長鏈非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNACRNDE在許多癌組織或細(xì)胞中處于高表達(dá)狀態(tài)，其中在宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織[26]。根據(jù)這一研究發(fā)現(xiàn)我們猜測，LncRNACRNDE可以為宮頸癌的診斷、治療及預(yù)后提供理論依據(jù)，有助于進(jìn)一步尋找腫瘤標(biāo)志物。長鏈非編碼RNAFAL1在多種腫瘤組織（如宮頸癌、乳腺癌等）中表達(dá)異常，并發(fā)現(xiàn)其具有激活原癌基因的生物學(xué)功能。Hui等[27]利用qRT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中FAL1基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)FAL1在Hela細(xì)胞中較正常人宮頸細(xì)胞中處于高表達(dá)量；將FAL1的siRNA片段轉(zhuǎn)染至宮頸癌Hela細(xì)胞中，并檢測其沉默效率，轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞中FAL1的表達(dá)量下調(diào)，Hela細(xì)胞的增殖和侵襲遷移力也受到明顯抑制。該研究顯示，F(xiàn)AL1在宮頸癌中起著癌基因的作用，可以促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。因此，LncRNAFAL1可以作為治療宮頸癌的又一重要的基因作用靶點(diǎn)，這一理論依據(jù)為研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了新思路。

5 小結(jié)

目前，隨著新技術(shù)新方法地不斷涌現(xiàn)，宮頸癌的治療方法也不斷增加，在很大程度上可以克服傳統(tǒng)宮頸癌治療方法的不足，為優(yōu)化和改進(jìn)治療新方法提供新思路和新方向。但是宮頸癌的有效預(yù)防和根治目前仍處于研究階段，隨著多學(xué)科交叉的發(fā)展及應(yīng)用，尤其是精準(zhǔn)醫(yī)療的提出，必將為宮頸癌精準(zhǔn)治療方法的研究和應(yīng)用帶來新的突破。