豚鼠乳鼠心房肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的探討＊

吳 蔚，佡劍非，王曉萍，邵 冰

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科110002；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng)110001）

自1960年Harary 等［1］首次對(duì)豚鼠乳鼠的心房肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以來(lái)，心房肌細(xì)胞培養(yǎng)被廣泛地應(yīng)用于心血管疾病的研究，其原因在于體外培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞能夠保持其在體內(nèi)原有的許多結(jié)構(gòu)和功能，并具有自發(fā)性節(jié)律搏動(dòng)，且心肌細(xì)胞的培養(yǎng)具有簡(jiǎn)便、定量、重復(fù)性好以及不受神經(jīng)體液因素的影響等特點(diǎn)［2］，進(jìn)而在心血管疾病研究領(lǐng)域中起到了不可替代的作用。然而，由于心房肌細(xì)胞易受損傷、不易傳代等特點(diǎn)，目前多數(shù)學(xué)者應(yīng)用原代培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。那么，探索出合適的心房肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，使得心房肌細(xì)胞達(dá)到理想的數(shù)量、存活率、純化率和細(xì)胞活力，是體外培養(yǎng)心房肌細(xì)胞模型的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)參照了Simpson 等［3］心房肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法并加以改進(jìn)，探討豚鼠乳鼠心房肌細(xì)胞培養(yǎng)的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇出生1～2 d 的豚鼠的乳鼠，雌雄不限，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.2 儀器與試劑DMEM低糖培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone 公司），胎牛血清（美國(guó)Hyclone 公司），胰蛋白酶（天津?yàn)笤噭┕荆?，Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Gibco 公司），D-Hanks 液（自配），溴脫氧尿核苷（Brdu，美國(guó)Sigma 公司），雙抗液（美國(guó)Sigma 公司），兔抗大鼠心房肌肌鈣蛋白I（c TnI）抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司），F(xiàn)ITC 標(biāo)記羊抗兔二抗（北京中杉試劑公司），超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)儀器設(shè)備公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus 公司），倒置相差光學(xué)顯微鏡（日本Ol ympus 公司），離心機(jī)（ST-21 Sorvall，美 國(guó)），恒 溫 振 蕩 水 浴 箱（Grant OLS200，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 心房肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 取1～2 d 的豚鼠乳鼠5只，無(wú)菌條件下開(kāi)胸取出心臟，用預(yù)冷的D-Hanks 液洗滌1遍，然后用兩把眼科彎鑷子將心房分離下來(lái)，再用預(yù)冷的DHanks 液洗滌2 遍，剪成約1mm3碎塊，加入4～5 倍體積的0.06%的胰酶并放入37 ℃恒溫振蕩水浴箱中，震蕩（頻率：75 r／min）消化心房肌組織7.5 min，第1 次消化后自然沉淀并棄上清液，并用D-Hanks液洗滌1遍，然后從第2次開(kāi)始用0.08%Ⅱ型膠原酶消化，前后消化4 次，每次加入后吹打15 次左右，每次消化時(shí)間7.5 min，消化后再次吹打20 次左右，自然沉淀后，吸出每次分離的上清液加入等量含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液，前2 次和后2 次各放入1 個(gè)15mL離心管中，經(jīng)200 目濾網(wǎng)過(guò)濾，然后4 ℃850r／min 離心8 min，離心后棄掉上清液，各加入1.5 m L培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，各吸入6 孔板中，再將其吹勻，各吸出0.5 m L放入另一孔中，然后將6 孔板放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60min 后，采用差速貼壁分離技術(shù)，吸出細(xì)胞懸液，分別放入另3 個(gè)孔中，再放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 min 后，采用同樣的方法再次分別放入另一個(gè)6 孔板的3 個(gè)孔中，前3d 滴入5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）使其終濃度為0.1 mmol／L，并繼續(xù)培養(yǎng)，24、48 h 都進(jìn)行換液，以后隔日換液。

1.3.2 心房肌細(xì)胞數(shù)量及存活率的測(cè)定 兩孔中各取40μL細(xì)胞懸液，并分別加入160μL 的0.4%臺(tái)盼藍(lán)液，混勻后再取適量混合液滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，隨機(jī)取10 個(gè)低倍（10 ×）視野計(jì)數(shù)4 個(gè)大格中的細(xì)胞總數(shù)及未染成藍(lán)色的活細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)10 次，取平均值。細(xì)胞存活率＝活細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.3 心房肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率及搏動(dòng)率的觀察 培養(yǎng)3 d 的心房肌細(xì)胞在倒置顯微鏡下先計(jì)數(shù)聚集成心房肌細(xì)胞簇的心房肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率，再隨機(jī)在高倍（20 ×）視野中，計(jì)數(shù)600 個(gè)心房肌細(xì)胞中搏動(dòng)心房肌細(xì)胞數(shù)，得出心房肌細(xì)胞搏動(dòng)率（細(xì)胞搏動(dòng)率＝搏動(dòng)細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%），隨機(jī)觀察培養(yǎng)4 d的心房肌細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況。

1.3.4 心房肌細(xì)胞純度的鑒定 取培養(yǎng)72 h 的心房肌細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定，用兔抗大鼠肌鈣蛋白I 抗體作為一抗，山羊抗兔IgG作為二抗熒光蛋白，采用細(xì)胞免疫熒光法，用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為一抗的陰性對(duì)照。隨機(jī)取10 個(gè)高倍（20 ×）視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞率＝陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)心房肌細(xì)胞的情況 本實(shí)驗(yàn)采用前2 次、后2 次和前后4 次消化后的細(xì)胞分別培養(yǎng)法，觀察3 者對(duì)心房肌細(xì)胞產(chǎn)量、存活率、純化率和活力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用上述方法中的后2 次消化培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞總數(shù)、存活率和活力更為理想（圖1、圖2）。

2.2 培養(yǎng)心房肌細(xì)胞的形態(tài)變化 在兩次差速貼壁后，在倒置顯微鏡下觀察到心房肌細(xì)胞形態(tài)，最初為圓形或橢圓形，4 h后，開(kāi)始有心房肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，此時(shí)的形態(tài)為柱狀梭形、長(zhǎng)三角形、短三角形；12 h 后，細(xì)胞逐漸在瓶壁表面鋪展，此時(shí)大多數(shù)心房肌細(xì)胞已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，此時(shí)可見(jiàn)少數(shù)單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始搏動(dòng)，頻率不一；24 h 后，能貼壁生長(zhǎng)的心房肌細(xì)胞幾乎都已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞鋪展?fàn)顩r更加明顯，并伸出偽足，形態(tài)上多數(shù)細(xì)胞逐漸變成不規(guī)則的星形；1～2 d 后，偽足可相互接觸交織成網(wǎng)，形成細(xì)胞單層或細(xì)胞簇，呈放射狀排列的同心圓狀，其搏動(dòng)同步化，形成所謂功能性合體細(xì)胞（圖3）；至3 d 時(shí)，自發(fā)搏動(dòng)頻率和波動(dòng)率都達(dá)高峰，計(jì)數(shù)培養(yǎng)10 次的平均搏動(dòng)頻率為每分鐘116～119 次，平均搏動(dòng)率為89%～92%；至5～6d 時(shí)搏動(dòng)頻率及波動(dòng)率開(kāi)始減少。

2.3 心房肌細(xì)胞純度的鑒定24 孔板爬片培養(yǎng)4 d 的心房肌細(xì)胞，以兔抗大鼠肌鈣蛋白I 抗體作為一抗，山羊抗兔IgG作為二抗熒光蛋白，用細(xì)胞免疫熒光法，可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)染色呈綠色；細(xì)胞核呈藍(lán)色，非心房肌細(xì)胞只有細(xì)胞核呈藍(lán)色。結(jié)果顯示幾乎所有的細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性，說(shuō)明此時(shí)培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞較純，見(jiàn)圖1、圖4。

圖1 3組消化后的心房肌細(xì)胞存活率及培養(yǎng)4 d的純化率和活力

圖2 3組消化后培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞密度和總數(shù)

圖3 3組消化后培養(yǎng)4d 的心房肌細(xì)胞（×200）

圖4 3組消化后培養(yǎng)4d 的心房肌細(xì)胞、兔抗大鼠心房肌肌鈣蛋白I、山羊抗兔IgG（×400）

3 討 論

近年來(lái)生物起搏器（biological pacemaker）研究已成為緩慢性心律失常治療領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，人們對(duì)心房肌細(xì)胞的研究越來(lái)越深入。心房肌細(xì)胞原代培養(yǎng)不受神經(jīng)、體液等因素影響，在實(shí)驗(yàn)研究中具有舉足輕重的作用。然而，由于心房肌細(xì)胞有易受損傷、不易傳代等特點(diǎn)，所以如何控制大鼠心房肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響因素，進(jìn)而得到純化好、存活率和活力高的心房肌細(xì)胞，是實(shí)驗(yàn)成功一個(gè)關(guān)鍵因素。

本實(shí)驗(yàn)利用酶分解法［4］，即0.06%的胰蛋白酶消化1 次，再用0.08%Ⅱ型膠原酶重復(fù)消化4 次，并采用差異性貼壁技術(shù)及添加Brdu 純化細(xì)胞的方法分離豚鼠乳鼠心房肌組織，以獲得高產(chǎn)量、高活力的心房肌細(xì)胞?，F(xiàn)對(duì)豚鼠乳鼠心房肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要影響因素進(jìn)行總結(jié)如下：

3.1 實(shí)驗(yàn)豚鼠的選擇 許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)成年大鼠心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，不具有分裂增殖能力，乳鼠在出生后3 d 內(nèi)心肌細(xì)胞都有增殖能力，但大鼠出生后時(shí)間越短，其心肌細(xì)胞分離后存活率越高，越容易貼壁生長(zhǎng)［5］。而豚鼠在出生后1～3 d 的心房肌細(xì)胞都有增殖能力，可用于心房肌細(xì)胞培養(yǎng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，以半日齡為好［6］。作者對(duì)出生半日到3 d 的乳鼠進(jìn)行心房肌細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)胎齡為1～2 d 最好，原因可能是：（1）對(duì)于1～3 d 的乳鼠，消化酶對(duì)細(xì)胞影響較大；（2）對(duì)于半日齡的乳鼠，心肌細(xì)胞對(duì)酶的反復(fù)消化耐受差，消化過(guò)程不好控制以致細(xì)胞的存活率和活力不理想，并且心臟小，細(xì)胞數(shù)量較少；（3）對(duì)于2～3 d 的乳鼠，心房肌細(xì)胞增殖和貼壁生長(zhǎng)能力較1～2 d 的乳鼠差，消化后細(xì)胞的存活率和活力也不理想；（4）對(duì)于1～2 d 的乳鼠，消化過(guò)程好控制，消化后心房肌細(xì)胞數(shù)量也較多，且存活率較高，活力較好。

3.2 消化酶種類的選擇 心房肌細(xì)胞能否培養(yǎng)成功的關(guān)鍵是減輕分離過(guò)程對(duì)細(xì)胞的損傷。有學(xué)者認(rèn)為“單純應(yīng)用胰蛋白酶消化對(duì)細(xì)胞的存活率有極大的負(fù)面影響”［7］。分離心房肌細(xì)胞常用的消化液有胰蛋白酶（一般與依地酸二鈉聯(lián)合應(yīng)用，可降低細(xì)胞損害）和膠原酶［8-9］。二者的目的是使組織塊分散為單個(gè)細(xì)胞，利于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。無(wú)論是胰蛋白酶還是膠原酶，其濃度較低為好，本實(shí)驗(yàn)選用0.06%的胰蛋白酶（含EDTA）消化1 次，從第2 次開(kāi)始用0.08%Ⅱ型膠原酶重復(fù)消化4 次，就是較好的例子。其原因是0.06%的胰蛋白酶不但對(duì)心房肌細(xì)胞損害小，而且分解組織間質(zhì)蛋白的作用較膠原酶強(qiáng)，有利于達(dá)到第1 次棄上清液的消化目的，第2 次開(kāi)始用0.08%Ⅱ型膠原酶，通過(guò)消化細(xì)胞間膠原蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)游離心房肌細(xì)胞的目的，這與胰蛋白酶消化的機(jī)制不同，而且作用溫和，消化的時(shí)間長(zhǎng)短容易控制，消化次數(shù)（與高濃度的消化酶相比，如果消化酶濃度大，需要短時(shí)間多次消化）較少。作者嘗試過(guò)用0.125%胰酶進(jìn)行短時(shí)間、多次消化，然而消化時(shí)間不易控制，效果不理想?？傊x用低濃度的，聯(lián)合應(yīng)用兩種消化酶更適合心房肌細(xì)胞培養(yǎng)，這可能是今后心房肌細(xì)胞培養(yǎng)的共同趨勢(shì)。

3.3 心房肌細(xì)胞純化方法的選擇 消化分離后通常存在兩種細(xì)胞：心房肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞較心房肌細(xì)胞更容易貼壁且具有分裂增殖能力，如果處理不當(dāng)，很容易成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生極大的影響。因此，在心房肌細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)盡可能地去除成纖維細(xì)胞，以達(dá)到較為純化的心房肌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面貼壁生長(zhǎng)的速度不同的特點(diǎn)，采用兩次差速貼壁分離法［10-11］（每次60 min）和加入Brdu［3，12］通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)取代胸腺嘧啶脫氧核苷，抑制DNA復(fù)制，進(jìn)而抑制混雜于心房肌細(xì)胞中的少量成纖維細(xì)胞增生，并對(duì)心房肌細(xì)胞無(wú)毒性及抑制作用，可得到純度為95.4%～96.2%的心房肌細(xì)胞。

綜上所述，心房肌原代培養(yǎng)在心血管領(lǐng)域中具有重要的作用。那么，如何在心房肌細(xì)胞原代培養(yǎng)中獲得達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的心房肌細(xì)胞數(shù)量、存活率、純化率和活力是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。本研究介紹的利用低濃度酶消化原代培養(yǎng)心房肌細(xì)胞方法，細(xì)胞純化率高、活力高、細(xì)胞數(shù)量較多、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，且最為值得關(guān)注的是實(shí)驗(yàn)操作的可控制性強(qiáng)，是一種較為理想的心房肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，可廣泛地用于建立病理生理模型，研究細(xì)胞電生理、蛋白及基因的表達(dá)，從而探索以基因治療為基礎(chǔ)的生物起搏器在治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征中的新途徑。

［1］ Harary I，F(xiàn)arly B.In vitro studies of single isolated beating heart cells［J］.Science，1960，131（3414）：1674-1675.

［2］ 郝亞榮，李建軍.乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)［J］.心臟雜志，2001，13（6）：473-475.

［3］ Simpson P，Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells.Cross-striations，ultrastructure，and chronotropic response to isoproterenol［J］.Cirac Res，1982，50（1）：101-106.

［4］ Brand NJ，Lara-Pezzi E，Rosenthal N，et al.Analysis of cardiac myocyte biology in transgenic mice：a protocol for preparation of neonatal mouse cardiac myocyte cultures［J］.Methods Mol Biol，2010，633（5）：113-124.

［5］ 譚玉珍，王海杰.生后不同時(shí)間乳鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能特征［J］.解剖學(xué)報(bào)，2009，40（4）：567-572.

［6］ 劉霞，王常勇.新生大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，33（6）：35-37.

［7］ 郭軍，鮑翠玉，林國(guó)生，等.新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法的改進(jìn)［J］.心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2006，15（6）：538-540.

［8］ 王佳南，張曉剛，湯為學(xué)，等.新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良［J］.重慶醫(yī)科 大 學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34（5）：600-603.

［9］ Ramos-Mondrag ón R，Vega AV.Long-term modulation of Na＋and K＋channels by TGF-β1 in neonatal rat cardiac myocytes［J］.Pflugers Arch，2011，461（2）：235-247.

［10］ 龐勇軍，孫莉，謝文娟，等.新生大鼠心肌細(xì)胞分離、純化及培養(yǎng)方法的改進(jìn)［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，31（4）：520-523.

［11］ Bes S，Roussel P，Laubriet A，et al.Influence of deep hypothermia on the tolerance of the isolated cardiomyocyte to ischemia-reperfusion［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33（11）：1973-1988.

［12］ Chiu CZ，Wang BW，Chung TH，et al.AngiotensinⅡand the ERK pathway mediate the induction of myocardin by hypoxia in cultured rat neonatal cardiomyocytes［J］.Clin Sci（Lond），2010，119（7）：273-282.