一株耐鹽乙草胺降解菌的分離、篩選及鑒定

王苑力 李海峰 符加珂 張?jiān)玛?yáng) 屈建航 田海龍

摘 要：為獲得更加適應(yīng)自然環(huán)境的乙草胺降解菌株，以MSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基從常年經(jīng)受乙草胺污染的農(nóng)田土壤中分離乙草胺降解菌，篩選高效降解菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定及生長(zhǎng)和降解特性分析。結(jié)果表明，共分離得到乙草胺降解細(xì)菌12株，通過(guò)高效液相色譜法定量檢測(cè)確定菌株ACD-9的降解效率最高，3 d內(nèi)對(duì)初始濃度為50·mg·L-1的乙草胺降解率可達(dá)到56.78 %；從菌落特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列3個(gè)方面分析，鑒定菌株ACD-9為芽孢桿菌（Bacillus sp.）；菌株ACD-9可在溫度4～50 ℃、pH值4.5～10.0、NaCl質(zhì)量濃度為0～150 g·L-1的條件下生長(zhǎng)，其最適條件為46 ℃，pH值 5.0～6.0，NaCl 0～10 g·L-1。綜合而言，菌株ACD-9環(huán)境耐受力較好，適應(yīng)能力較強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：乙草胺；降解菌；芽孢桿菌；耐鹽性

中圖分類號(hào)：S482.4+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.12.022

Abstract： To obtain bacterial strains that could adapt a wide range of natural environment conditions， mineral salts medium （MSM） was used to isolate acetochlor-degrading bacteria from the soils that were subject to acetochlor contamination many years. The strain with higher acetochlor-degrading efficiency was screened and identified， and the growth and acetochlor degrading characteristics were also studied. The results showed that 12 acetochlor-degrading bacterial strains were obtained in total， in which ACD-9 was certified as the highest efficiency strain through high performance liquid chromatography （HPLC） method， and the 3rd day acetochlor degradation rate was 56.78% for 50 mg·L-1 acetochlor of in the liquid. According to the results of colony morphology， physiological and biochemical characteristics， and 16S rRNA gene sequence analyses， ACD-9 was identified as a member of Bacillus. ACD-9 could grow under the condition of 4～50 ℃， pH 4.5～10.0， and 0～150 g·L-1 NaCl， while the optimal condition was 46 ℃， pH 5.0～6.0，0～10 μg·L-1 NaCl. In conclusion， ACD-9 had good tolerance and adaptation for environment， which could be applied with a good prospect.

Key words： acetochlor； degrading bacteria； Bacillus； salt tolerance

乙草胺（acetochlor）又名禾耐斯，是一種酰胺類除草劑，主要用于一年生禾本科雜草和部分小粒種子闊葉雜草的防除[1]，是我國(guó)生產(chǎn)量和使用量最多的三大除草劑之一[2]。但是，由于乙草胺在水中的溶解度較大，遷移性較強(qiáng)，不易光解和揮發(fā)[3]，導(dǎo)致其降解周期較長(zhǎng)，很容易在土壤中殘留并對(duì)農(nóng)作物造成藥害，引起環(huán)境污染。由于大量使用乙草胺，其在很多作物或食品中已被檢出，對(duì)人類的健康構(gòu)成了一定威脅。此外，乙草胺還可致兩棲動(dòng)物肝臟、小鼠的骨髓受損以及蟾蜍胚胎畸形發(fā)育，職業(yè)性接觸乙草胺對(duì)人類精液質(zhì)量也有顯著影響[4]。目前，乙草胺已經(jīng)被美國(guó)環(huán)境保護(hù)局定為B-2類致癌物[5]。由此可見(jiàn)，提高環(huán)境中乙草胺的降解率，減少農(nóng)田中乙草胺的殘留危害，在食品安全領(lǐng)域具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

微生物作為農(nóng)田中農(nóng)藥殘留的主要降解者，因具有針對(duì)性強(qiáng)、周期短、見(jiàn)效快、費(fèi)用小、環(huán)境代價(jià)小、可最大限度地降低農(nóng)藥污染物的濃度等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為農(nóng)藥污染土壤生物修復(fù)研究的熱點(diǎn)。目前，已報(bào)道的乙草胺降解菌主要分布于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）、申氏桿菌屬（Shinella sp.）、粘著劍菌屬（Ensifer sp.）、副球菌屬（Paracoccus sp.）等[3，6-9]。XU等[7]從乙草胺污染土壤中分離到的食油假單胞菌（Pseudomonas oleovorans）LCa2菌株，對(duì)7.6 mg·L-1乙草胺的7 d降解率為98.03 %；倪俊等[3]分離得到了一株申氏桿菌（Shinella sp.），能在48 h內(nèi)高效降解50 mg·L-1的乙草胺；董濱等[6]獲得的粘著劍菌（Ensifer adhaerens）A-3菌株，可以乙草胺作為唯一氮源，10 d對(duì)10 mg·L-1乙草胺的降解率為33.6 %。此外，也有一些在極端環(huán)境下適應(yīng)性較強(qiáng)的農(nóng)藥降解菌的報(bào)道，如熊海錚[10]從土壤中篩選到一株可耐受鹽濃度為10%的芽孢桿菌（Bacillus sp.）e5菌株，2 d內(nèi)對(duì)50 mg·L-1廣滅靈的降解率為32%；孫雪瑩[11]在寡營(yíng)養(yǎng)條件下獲得一株異養(yǎng)硝化菌（Stenotrophomonas sp.），能夠有效降解阿特拉津；楊德玉等[12]從土壤中分離出一株莠去津降解菌SY-AD-9，耐鹽極限能達(dá)到14%。但目前關(guān)于環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)的乙草胺降解菌研究報(bào)道還較少。

本研究從長(zhǎng)期受乙草胺污染的農(nóng)田土壤中分離、篩選出一株能夠適應(yīng)自然環(huán)境的高效降解菌株，并對(duì)其生長(zhǎng)特征、生理生化特性等方面進(jìn)行研究，旨在為修復(fù)乙草胺等酰胺類除草劑污染的土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材 料

土壤樣品采自山西省原平市田間常年遭受乙草胺污染的玉米根際土壤。

篩選培養(yǎng)基為基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基（Mineral salts medium，MSM）：（NH4）2SO4 1 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 1 g，微量元素溶液1 mL，瓊脂18 g，加蒸餾水溶解并定容至1 L，pH值7.0，121 ℃滅菌30 min。其中微量元素溶液包含MnSO4·H2O 0.13 g，ZnC12 0.23 g，CuSO4·H2O 0.03 g，CoC12·6H2O 0.42 g，NaMoO4·2H2O 0.15 g，A1C13·6H2O 0.05 g，加蒸餾水溶解并定容至1 L。

MSM液體培養(yǎng)基同基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基（不添加瓊脂）。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加蒸餾水溶解并定容至1 L，pH值7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.2 方 法

1.2.1 乙草胺降解菌株的富集培養(yǎng) 將5 g土壤樣品加入到100 mL乙草胺初始濃度為50 mg·L-1的MSM液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，180 r·min-1搖床中進(jìn)行富集培養(yǎng)，7 d后取上清液5 mL轉(zhuǎn)接至新的含乙草胺的MSM液體培養(yǎng)基中，重復(fù)此操作3次，取1 mL上清液按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋，將稀釋后的溶液分別涂布于含100 mg·L-1乙草胺的MSM固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

1.2.2 高效降解菌株的復(fù)篩 用接種環(huán)挑取不同形態(tài)的單菌落于相同底物濃度的MSM固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)。連續(xù)純化3代后，分別命名為ACD-1、ACD-2、ACD-3……，并接種于乙草胺濃度為50 mg·L-1的MSM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，取培養(yǎng)液于10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，0.22 μm水系濾膜過(guò)濾并超聲除氣，利用高效液相色譜儀（Agilent 1260 infinity Ⅱ）分析培養(yǎng)前后樣品中乙草胺含量的變化，并計(jì)算乙草胺的降解率。液相條件為流動(dòng)相乙腈∶水（90∶10，V/V），分析柱為Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃。將乙草胺降解能力較好的菌株保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.3 菌株鑒定 將所獲得的降解菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，得到單菌落并觀察其形態(tài)；常規(guī)的生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]進(jìn)行；細(xì)菌總DNA采用生工B518255-0100細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取。擴(kuò)增引物為16S rRNA基因的通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行克隆、測(cè)序與比對(duì)[14]，并利用MEGA 3.1[15]以Neighbor-joining[16]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 高效降解菌株ACD-9的生長(zhǎng)特性 將降解菌株ACD-9在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按照1 %的接種量接種于溫度分別為4，15，28，37，42，46，50 ℃，pH值分別為4.5，5，6，7，8，

9，10，NaCl質(zhì)量濃度分別為0，10，50，80，150 g·L-1的LB液體培養(yǎng)基中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在37 ℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，用分光光度計(jì)檢測(cè)600 nm下的OD值，研究不同條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

測(cè)得的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行整理，使用SAS 9.1.3數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析，并采用Turkey HSD進(jìn)行多重性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙草胺降解菌株的篩選

從常年經(jīng)受乙草胺污染的玉米根際土壤中篩選出能夠降解乙草胺的菌株共12株，各菌株對(duì)液體培養(yǎng)基中乙草胺的降解情況如圖1所示。其中，菌株ACD-2、ACD-9、ACD-12的降解能力較好，降解率分別為44.31%，56.78%，47.67%，顯著高于其他菌株（P<0.05），三者之間亦存在顯著差異（P<0.05），故最終確定菌株ACD-9作為高效乙草胺降解菌株用于后續(xù)研究。

2.2 菌株ACD-9的鑒定

綜合菌株ACD-9的菌落形態(tài)、部分生理生化特性和16S rRNA基因序列的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株ACD-9在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3 d后，菌落不規(guī)則、中心呈淡紅色、表面干燥、并出現(xiàn)褶皺（如圖2-a），菌體為短桿狀（如圖2-b），可見(jiàn)芽孢；甲基紅試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，具有運(yùn)動(dòng)性，能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶、淀粉酶，可還原硝酸鹽，利用檸檬酸鹽；通過(guò)對(duì)菌株16S rRNA基因的克隆，獲得1 454 bp的序列，Blast比對(duì)結(jié)果表明，其與芽孢桿菌（Bacillus sp.）的16S rRNA基因的同源性為99%，從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）中的位置也可判斷，菌株ACD-9與芽孢桿菌屬的菌株均聚在一起，所以確定菌株ACD-9為芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

2.3 菌株ACD-9的生長(zhǎng)特性

由圖4～6可知，菌株ACD-9在溫度4～50 ℃、pH值4.5～10.0、NaCl質(zhì)量濃度0～150 g·L-1的條件下均能生長(zhǎng)，表明該菌株的適應(yīng)范圍較廣，環(huán)境耐受力較好。其中在46 ℃時(shí)菌株的OD600值顯著高于其他溫度（P<0.05）； pH值為5.0和6.0時(shí)菌株生長(zhǎng)狀況均顯著優(yōu)于其他條件（P<0.05），但5.0和6.0之間差異不顯著（P>0.05）；在不同的NaCl質(zhì)量濃度條件下，0～10 g·L-1菌株的生長(zhǎng)均顯著優(yōu)于50，80，150 g·L-1（P<0.05），但0 g·L-1和10 g·L-1之間差異不顯著。由此可見(jiàn)，菌株ACD-9最適生長(zhǎng)條件是溫度46 ℃，pH值5.0～6.0，鹽濃度0～10 g·L-1。

3 結(jié)論與討論

本研究從常年經(jīng)受乙草胺污染的玉米根際土壤中分離篩選得到一株耐高溫高鹽度的乙草胺降解菌株ACD-9，經(jīng)鑒定其為芽孢桿菌（Bacillus sp.），該菌株的最適生長(zhǎng)條件為：溫度46 ℃，pH值5.0～6.0，NaCl質(zhì)量濃度0～10 g·L-1，在3 d內(nèi)對(duì)50 mg·L-1的乙草胺降解率可達(dá)到56.78%。此外，菌株ACD-9在溫度4～50 ℃、pH值4.5～10.0、NaCl質(zhì)量濃度0～150 g·L-1的條件下均能生長(zhǎng)，其環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)，可進(jìn)一步豐富實(shí)際應(yīng)用中乙草胺的降解和農(nóng)作物藥害修復(fù)研究的菌種資源。芽孢桿菌屬是污染物降解中較為常見(jiàn)的一個(gè)屬，由于產(chǎn)芽孢的特性，環(huán)境耐受力較好，但迄今為止對(duì)于能耐受較高溫度和鹽度的乙草胺降解菌的報(bào)道較少。陳森等[17]報(bào)道的乙草胺降解菌系HXDW在1%～2%鹽濃度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，而在本研究中，菌株ACD-9在0～10 %鹽濃度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，表明此菌株能夠耐受更高的鹽濃度；XU等[7]報(bào)道的乙草胺降解菌（Pseudomonas）LCa2的最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃，而菌株ACD-9在4～50 ℃溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，最適培養(yǎng)溫度高達(dá)46 ℃，對(duì)高溫的耐受力較好。因此，本研究獲得的ACD-9菌株的環(huán)境適應(yīng)力更強(qiáng)，可以考慮作為在高溫地區(qū)、高鹽農(nóng)田等要求更多的環(huán)境中生長(zhǎng)和發(fā)揮降解作用的候選菌種應(yīng)用。

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