糖尿病性視網(wǎng)膜病變基因治療的研究進(jìn)展

姚謝怡+許迅

摘 要 糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病的最常見(jiàn)微血管并發(fā)癥之一，是一類(lèi)可引起嚴(yán)重視力損害甚至失明的慢性、進(jìn)展性眼部疾病。目前，DR治療有視網(wǎng)膜激光光凝、局部注射糖皮質(zhì)激素類(lèi)和抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類(lèi)藥物等方法，但它們均有局限性和副作用。近年來(lái)，隨著越來(lái)越多的DR相關(guān)基因標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)以及基因載體得到優(yōu)化，一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已顯示出了基因治療在減少視網(wǎng)膜新生血管、保護(hù)視網(wǎng)膜血管及神經(jīng)功能和改變DR相關(guān)表觀基因修飾方面的作用?；蛑委熅哂邢鄬?duì)長(zhǎng)效且副作用小的優(yōu)勢(shì)，有望成為DR的新型治療手段。

關(guān)鍵詞 糖尿病性視網(wǎng)膜病變 基因治療 新生血管

中圖分類(lèi)號(hào)：R774.1； R587.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2017）23-0015-05

Progress of gene therapy in diabetic retinopathy

YAO Xieyi*， XU Xun**

（Department of Ophthalmology， Shanghai General Hospital， Shanghai Jiao Tong University； Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Disease； Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine， Shanghai 200080， China）

ABSTRACT Diabetic retinopathy （DR）， one of the major microvascular complications of diabetes mellitus， is a chronic and progressive sight-threatening ocular disease. Currently， the treatment of DR including laser photocoagulation， intravitreal injection of corticosteroid and anti-vascular endothelial growth factor agents has its limits and adverse effects. A number of studies have shown that the gene therapy can play an important role in retinal angiogenesis inhibition， vascular and neuronal protection and epigenetic modification related to DR with the identification of genetic biomarkers of DR and the optimization of different gene vectors. Gene therapy， which has a longer duration of therapeutic effect and potentially fewer adverse reactions， is expected to be a novel method for the treatment of DR.

KEY WORDS diabetic retinopathy； gene therapy； neovascularization

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病的最常見(jiàn)微血管并發(fā)癥之一，是一類(lèi)慢性、進(jìn)展性的眼部疾病，已成為工作人群失明的首要原因。在罹患2型糖尿病>20年的患者中，>60%的患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的視網(wǎng)膜病變[1]。隨著全球糖尿病患者數(shù)持續(xù)增加，DR的患病率也隨之升高。據(jù)估計(jì)，到2050年，單在美國(guó)>40歲人群中就將有1 600萬(wàn)人出現(xiàn)DR的臨床表現(xiàn)，其中300多萬(wàn)人將遭受?chē)?yán)重視力損害，給社會(huì)及經(jīng)濟(jì)帶來(lái)沉重的壓力[2]。

1 發(fā)病機(jī)制和治療現(xiàn)狀

DR的發(fā)病機(jī)制至今仍未得到完全闡明，現(xiàn)認(rèn)為主要與晚期糖基化終末產(chǎn)物的堆積、多元醇通路的激活、氨基己糖通路的激活、蛋白激酶C通路的激活和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的激活相關(guān)。上述通路的激活均會(huì)最終導(dǎo)致氧化或硝化應(yīng)激、慢性炎癥反應(yīng)、微血管和線(xiàn)粒體功能障礙，促使DR發(fā)生和發(fā)展[3]。此外，視網(wǎng)膜神經(jīng)元損害和膠質(zhì)過(guò)度增生也與早期DR的發(fā)生相關(guān)[4]。

由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前治療DR的方法，如視網(wǎng)膜激光光凝、局部注射糖皮質(zhì)激素類(lèi)和抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）類(lèi)藥物、玻璃體切割術(shù)等，均有局限性和副作用。近年來(lái)受到極大關(guān)注的抗VEGF類(lèi)藥物雖可顯著改善DR患者的視覺(jué)，但由于半衰期短、需重復(fù)注射以維持療效，因此會(huì)引起一系列的注射相關(guān)并發(fā)癥，包括眼內(nèi)炎癥反應(yīng)、眼出血和眼壓升高，甚至導(dǎo)致更嚴(yán)重的眼內(nèi)炎[5]?？筕EGF類(lèi)藥物治療的長(zhǎng)期療效現(xiàn)也尚未得到明確，且隨著VEGF的水平下降，可能出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性變、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮等情況。此外，并非所有DR患者均對(duì)抗VEGF類(lèi)藥物治療敏感，臨床試驗(yàn)顯示雷珠單抗0.3 mg治療僅能使34% ～ 45%的糖尿病性黃斑水腫患者的視覺(jué)獲得顯著改善[6]，而應(yīng)答的不一致性可能與VEGF基因的多態(tài)性相關(guān)[7]。因此，臨床上仍迫切需要有新的、更有效的DR治療藥物和方法。

近年來(lái)有關(guān)DR的基因研究逐漸深入，主要包括候選基因研究、基因連鎖分析和全基因組關(guān)聯(lián)研究等，期望通過(guò)這些研究來(lái)尋找并解析不同的基因和單核苷酸變異、基因多態(tài)性與DR的易感性及其進(jìn)展之間的關(guān)聯(lián)。隨著抗VEGF治療已逐漸成為新生血管性眼病的主要治療方法，VEGF基因的多態(tài)性得到廣泛研究，而另一些特定的候選基因如醛糖還原酶、內(nèi)皮型一氧化氮、晚期糖基化終產(chǎn)物受體和促紅細(xì)胞生成素基因中的單核苷酸變異亦被發(fā)現(xiàn)在DR的發(fā)病機(jī)制中起著一定的作用[8]。endprint

2 基因治療的研究進(jìn)展

基因治療是指用正確的、正常的核苷酸序列替代患者機(jī)體細(xì)胞中引起疾病的有缺陷的基因中的核苷酸序列，借助基因置換、基因修正、基因修飾和基因滅活等手段來(lái)糾正或補(bǔ)償致病基因，進(jìn)而達(dá)到臨床治療目的的一種治療方法。在基因治療中，選用合適的載體將外源基因?qū)氚屑?xì)胞非常重要。目前，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)主要包括病毒依賴(lài)和非病毒依賴(lài)兩種方法。常用的病毒載體包括腺病毒相關(guān)病毒（adeno-associated virus， AAV）、腺病毒、慢病毒和單純皰疹病毒等，其中AAV具有宿主范圍廣、能轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞、免疫原性低、可在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)和安全、無(wú)致病性的優(yōu)點(diǎn)。在眼部疾病的基因治療中，幾乎半數(shù)臨床試驗(yàn)選用的載體均是AAV。作為唯一一種能有效轉(zhuǎn)染內(nèi)層視網(wǎng)膜細(xì)胞的AAV血清型，AAV-2在DR基因治療研究中的應(yīng)用最為廣泛[9]。非病毒依賴(lài)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)則借助現(xiàn)代理化方法將基因?qū)氚屑?xì)胞，與病毒載體相比，人工合成的非病毒依賴(lài)載體的免疫原性較低，且安全性高。此外，非病毒載體可攜帶更大負(fù)荷量的基因，也更易大量制備。隨著材料科學(xué)和納米技術(shù)的迅速發(fā)展，非病毒載體的基因轉(zhuǎn)移效率正在被慢慢提高，有望更多地應(yīng)用于基因治療[10]。

近年來(lái)，隨著越來(lái)越多的DR相關(guān)基因標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)以及基因載體得到優(yōu)化，基因治療作為DR的一種新型治療手段正越來(lái)越受到關(guān)注。目前，DR的基因治療研究主要著眼于減少DR病程中的新生血管、保護(hù)視網(wǎng)膜血管及神經(jīng)功能和改變DR相關(guān)表觀基因的修飾三個(gè)方面。

2.1 減少視網(wǎng)膜新生血管

促新生血管因子與抗新生血管因子間的失衡是引起視網(wǎng)膜新生血管的主要原因[11]，而視網(wǎng)膜新生血管是DR進(jìn)展期的主要特征。阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、重達(dá)促新生血管因子與抗新生血管因子間的平衡是DR基因治療的一大目標(biāo)。

2.1.1 拮抗促新生血管因子

作為參與視網(wǎng)膜新生血管和血視網(wǎng)膜屏障損害的關(guān)鍵因子，VEGF是DR基因治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。sFlt-1是VEGF受體-1的可溶性剪接變異體，作為胞外誘餌受體可結(jié)合循環(huán)中的VEGF和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子，從而產(chǎn)生新生血管抑制作用。在一系列的臨床前研究中，sFlt-1均被作為抑制視網(wǎng)膜新生血管的基因治療靶點(diǎn)，經(jīng)病毒載體轉(zhuǎn)染其基因片段后，視網(wǎng)膜的新生血管受到顯著的抑制[11-12]。此外，VEGF的作用也可在胞內(nèi)被阻斷。Flt23k由Flt-1中的VEGF結(jié)合域2、3和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列組成，作為一種內(nèi)感受器可同時(shí)阻斷VEGF的胞外信號(hào)通路并能在胞內(nèi)降解VEGF[13]。一項(xiàng)近期完成的研究顯示，由AAV-2轉(zhuǎn)染的Flt23k可在小鼠眼部通過(guò)下調(diào)VEGF表達(dá)而抑制脈絡(luò)膜新生血管[14]，但詳盡的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

2.1.2 增加抗新生血管因子

除拮抗促新生血管因子外，外源性增加抗新生血管因子也可重達(dá)正常的血管形成狀態(tài)。目前，已獲研究的抗新生血管因子包括色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor， PEDF）、組織金屬蛋白酶抑制劑-3（tissue inhibitor of metalloproteinases-3， TIMP-3）、內(nèi)皮抑素、血管抑素和尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase type plasminogen activator， uPA）的氨基端片段等[15]。許多研究者在高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在玻璃體腔內(nèi)注入病毒載體轉(zhuǎn)染的PEDF、TIMP-3、血管抑素、uPA的氨基端片段或內(nèi)皮抑素等基因均可下調(diào)視網(wǎng)膜中的VEGF表達(dá)，從而顯著減少視網(wǎng)膜新生血管[15]。Haurigot等[16]對(duì)同時(shí)具有非增殖性DR和視網(wǎng)膜新生血管的小鼠模型的玻璃體腔內(nèi)注入AAV-2轉(zhuǎn)染的PEDF基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單次注入即可獲得長(zhǎng)效的PEDF表達(dá)，由此顯著抑制視網(wǎng)膜新生血管、恢復(fù)視網(wǎng)膜的正常的血管密度。另一項(xiàng)近期完成的研究也發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中，使用新型載體pEPito轉(zhuǎn)染可使PEDF的過(guò)表達(dá)維持長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，且此期間視網(wǎng)膜中的VEGF表達(dá)顯著降低，由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)顯著減少，小膠質(zhì)細(xì)胞的活性及其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)亦顯著減少[17]。

2.2 保護(hù)視網(wǎng)膜血管及神經(jīng)功能

隨著對(duì)DR發(fā)病機(jī)制研究的深入，許多研究著眼于防止視網(wǎng)膜血管功能障礙和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡或損傷，在DR早期視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)損傷尚不嚴(yán)重時(shí)即采取保護(hù)性治療成為DR基因治療的一個(gè)新的切入點(diǎn)。

2.2.1 拮抗補(bǔ)體系統(tǒng)活化

正常的眼內(nèi)環(huán)境中因含有抑制補(bǔ)體系統(tǒng)活化的因子，補(bǔ)體介導(dǎo)的通路均處于靜止?fàn)顟B(tài)，而在罹患視網(wǎng)膜血管性疾病如DR時(shí)，眼內(nèi)的補(bǔ)體系統(tǒng)會(huì)被異常激活，形成攻膜復(fù)合體（membrane attack complex， MAC）。在DR的進(jìn)展過(guò)程中，MAC的過(guò)度產(chǎn)生一定程度上導(dǎo)致了血管內(nèi)皮和神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，而阻止MAC的形成及積聚可延緩DR的進(jìn)展[18]。Adhi等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，MAC的抑制劑可溶性CD59（soluble CD59， sCD59）具有保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免于損傷、同時(shí)維持血視網(wǎng)膜屏障完整性的作用：在鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病動(dòng)物模型中，通過(guò)玻璃體腔內(nèi)注入AAV-2/8轉(zhuǎn)染的sCD59基因可減少60%的視網(wǎng)膜血管滲漏；sCD59還可活化視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，后者能在短期內(nèi)減少神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell， RGC）的凋亡，但長(zhǎng)期效應(yīng)未知。

2.2.2 外源性補(bǔ)充神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

越來(lái)越多的研究表明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活及功能調(diào)節(jié)起著十分重要的作用。在這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）是DR進(jìn)展中最為主要的抗神經(jīng)元變性的保護(hù)因子，在缺氧環(huán)境下可增加興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的攝取，并上調(diào)Müller細(xì)胞中的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和谷氨酰胺合成酶的水平，起到神經(jīng)保護(hù)作用[20]。Gong等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組相比，玻璃體腔內(nèi)注入AAV轉(zhuǎn)染的BDNF基因可提高糖尿病大鼠RGC細(xì)胞的存活率并改善其視網(wǎng)膜功能。endprint

2.2.3 減少氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激在DR的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。在DR患者中，除一系列信號(hào)通路改變引起的活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）產(chǎn)生增加之外，抗氧化酶的活性及表達(dá)也顯著降低[22]。其中，錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase， MnSOD）是線(xiàn)粒體中的一種關(guān)鍵抗氧化酶，可將ROS轉(zhuǎn)變?yōu)槟茏杂煽缭骄€(xiàn)粒體膜的過(guò)氧化氫，從而減輕氧化應(yīng)激。在糖尿病動(dòng)物模型中，通過(guò)AAV轉(zhuǎn)染MnSOD基因可上調(diào)視網(wǎng)膜中的MnSOD水平及活性，從而顯著改善基底膜的厚度，并減少視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的凋亡、減少高糖環(huán)境導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損害，對(duì)糖尿病引起的微血管病變起到重要的預(yù)防作用[23]。

2.2.4 其他

血管生成素-1（angiopoietin-1， Ang-1）是血管生成素家族的一員，與血管生成素-2在高糖環(huán)境下有血管和神經(jīng)損傷作用不同，Ang-1是一種血管保護(hù)因子，與內(nèi)皮Tie2受體結(jié)合后可減少VEGF的表達(dá)及其所導(dǎo)致的鈣黏蛋白降解，維持內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，從而降低血管的通透性、減少血管滲漏。Cahoon等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，在Ins2Akita小鼠的玻璃體腔內(nèi)單次注入AAV-2轉(zhuǎn)染的COMP-Ang1基因可獲顯著且長(zhǎng)效的微血管和神經(jīng)損傷改善效果。

2.3 改變DR相關(guān)表觀基因修飾

表觀基因修飾在DR的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，其可在不改變DNA序列的情況下沉默或激活特定基因位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。表觀基因修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA的作用等，它們?cè)谔悄虿』颊咧芯驶钴S狀態(tài)，且與代謝記憶的發(fā)生密切相關(guān)[25]。

微小RNA（microRNA， miRNA）在DR相關(guān)表觀基因修飾中起著重要作用。miRNA是一類(lèi)小型非編碼RNA，可通過(guò)與各自的目標(biāo)信使RNA結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。通過(guò)收集DR和非DR患者的血清、玻璃體和房水等標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，一些在DR時(shí)表達(dá)水平發(fā)生顯著改變的miRNA已被發(fā)現(xiàn)[26]。一些以VEGF為作用靶點(diǎn)的miRNA如miR200b、miR-126、miR-15和let-7家族等可調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，下調(diào)VEGF和其他炎癥因子的水平，抑制視網(wǎng)膜新生血管和視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)，為DR治療研究提供了新的方向[27-29]。另外，一些與核因子-κB通路應(yīng)答相關(guān)的miRNA如miR146、miR155、miR132和miR-21等在DR的發(fā)病機(jī)制尤其是炎癥反應(yīng)中也起著重要的作用[28]。這些研究結(jié)果均表明，miRNA是DR的重要生物標(biāo)志物，可作為DR治療的新靶點(diǎn)。

3 基因治療的挑戰(zhàn)與展望

近年來(lái)，對(duì)惡性腫瘤等疾病，基因治療已逐漸步入臨床研究階段。眼部結(jié)構(gòu)小且封閉，僅需相對(duì)低量的載體就能進(jìn)行治療性基因轉(zhuǎn)染，加之血視網(wǎng)膜屏障的存在使得載體進(jìn)入全身循環(huán)的量很少，形成了一個(gè)相對(duì)免疫豁免的環(huán)境，眼部成為基因治療相對(duì)理想的器官。隨著對(duì)DR相關(guān)基因背景研究的逐漸深入，越來(lái)越多的與DR相關(guān)基因標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示出基因治療在DR中的潛在作用。

不過(guò)，基因治療必須考量載體的安全性與穩(wěn)定性，且治療過(guò)程中可能出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，使得非靶細(xì)胞也被轉(zhuǎn)染上外源性基因，從而引發(fā)一系列的不良反應(yīng)，加之DR本身的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，對(duì)DR的基因治療研究現(xiàn)仍停留在體外及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)階段，至今尚未進(jìn)行過(guò)有關(guān)DR基因治療的臨床試驗(yàn)。DR基因治療真正走入臨床還面臨巨大的挑戰(zhàn)，而克服阻礙仍主要有賴(lài)于基因治療相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，包括提高病毒載體的安全性及有效性、人工合成具有高轉(zhuǎn)染率的非病毒載體和找到更安全、更有效的基因轉(zhuǎn)染方法等，同時(shí)繼續(xù)深入探索DR的發(fā)病機(jī)制、篩選與DR發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的目的基因、關(guān)注miRNA在DR中的作用，尋找新的基因治療靶點(diǎn)。此外，一些新技術(shù)如CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)也將加快DR基因治療的發(fā)展[30]。目前，一項(xiàng)基因治療濕性老年性黃斑變性的臨床Ⅰ期單中心、隨機(jī)試驗(yàn)已獲得可喜的結(jié)果，證實(shí)了眼內(nèi)基因治療是一種相對(duì)長(zhǎng)效及安全的治療方法[31]。相信在不久的未來(lái)，基因治療必會(huì)成為DR的新治療手段之一。

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