食管癌中TAZ介導(dǎo)食管癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用

朱亞寧，張 千，孫蘇安，周靜芳，吳 健

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，并獲得遷移能力。EMT是上皮組織來(lái)源的惡性腫瘤獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程[1]。文獻(xiàn)報(bào)道很多信號(hào)通路參與腫瘤的EMT過(guò)程，如TGF-β1等[2]，但具體機(jī)制尚不清楚。有研究顯示TAZ在某些腫瘤中也參與EMT過(guò)程，如在口腔癌中TAZ不僅維持干細(xì)胞的自我更新，還促使癌由上皮細(xì)胞向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化，使口腔癌更具有侵襲性[3]。本文著重探討TAZ在食管癌中的表達(dá)及與EMT相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系，分析TAZ在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為食管癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集淮安市第一人民醫(yī)院2010年6月～2012年1月存檔的食管癌手術(shù)標(biāo)本143例，每例均有相應(yīng)癌旁組織。患者手術(shù)前均未接受任何放、化療。癌旁組織定義為據(jù)腫瘤組織5 cm以上的正常食管黏膜組織。

1.2材料TAZ兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，EMT相關(guān)抗體、二抗及DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)石蠟標(biāo)本，所有石蠟標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，65 ℃烤片2 h，脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓修復(fù)15 min，H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜；二抗及DAB顯色按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，稀氨水返藍(lán)，透明，中性樹膠封固。用各抗體已知陽(yáng)性表達(dá)的組織作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2結(jié)果判定 由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)免疫組化染色情況進(jìn)行綜合評(píng)分。TAZ蛋白陽(yáng)性定位于細(xì)胞核和胞質(zhì)，按陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分[4-9]：不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)分：≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～4分為陰性，5～12分為陽(yáng)性。E-cadherin陽(yáng)性定位于胞質(zhì)和胞膜，CK陽(yáng)性定位于胞質(zhì)，vimentin定位于胞質(zhì)，三者分別根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比例，<25%為陰性，≥25%為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率和組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確法。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TAZ與EMT相關(guān)蛋白在不同食管組織中的表達(dá)143例食管癌及癌旁組織中TAZ蛋白和vimentin蛋白在食管癌組織中的陽(yáng)性率(68.2%、15.4%)高于癌旁組織(19.6%、4.8%)，而E-cadherin蛋白和CKpan蛋白在食管癌組織中的陽(yáng)性率(75.5%、86%)均低于癌旁組織(均為100%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，圖1～8)。

2.2TAZ、E-cadherin表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系TAZ蛋白表達(dá)與食管癌分化程度和腫瘤分期具有相關(guān)性。TAZ蛋白在低分化食管癌中的表達(dá)明顯高于中+高分化食管癌組織(P=0.026)，在Ⅲ+Ⅳ期食管癌中的表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期食管癌(P=0.011)。E-cadherin蛋白的表達(dá)與食管癌腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性。E-cadherin蛋白在Ⅰ+Ⅱ期食管癌中的表達(dá)明顯高于Ⅲ+Ⅳ期食管癌組織(P<0.001)，在不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌中的表達(dá)明顯高于伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織(P<0.001，表2)。

2.3食管癌組織中TAZ與E-cadherin、CKpan、vimentin表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示：143例食管癌中CKpan與E-cadherin蛋白均陽(yáng)性者98例，均陰性者10例，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.239，P=0.004)，E-cadherin與vimentin蛋白均陽(yáng)性者10例，均陰性者22例，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.326，P<0.001，表3)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TAZ與E-cadherin蛋白均陽(yáng)性者58例，均陰性者9例，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.180，P=0.032)，TAZ與CKpan蛋白均陽(yáng)性者67例，均陰性者3例，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.215，P=0.01，表4)，TAZ與vimentin蛋白均陽(yáng)性者18例，均陰性者55例，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.200，P=0.017，表4)。

表1 TAZ與EMT相關(guān)蛋白在不同食管組織中的表達(dá)

表2 TAZ、E-cadherin表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

①②③④⑤⑥⑦⑧圖1 TAZ在癌旁組織中有少量表達(dá),SP法圖2 TAZ在食管癌中呈陽(yáng)性,SP法圖3 E-cadherin在癌旁組織中呈陰性,SP法 圖4 E-cadherin在食管癌組織中呈陽(yáng)性,SP法 圖5 CKpan在癌旁組織中呈陽(yáng)性,SP法 圖6 CKpan在食管癌組織中高表達(dá),SP法 圖7 vimentin在癌旁組織中呈陰性,SP法 圖8 vim-entin在食管癌組織中有極少量表達(dá),SP法

表3 食管癌組織中E-cadherin、CKpan、vimentin表達(dá)的相關(guān)性

表4 食管癌組織中TAZ與E-cadherin、CKpan、vimentin表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

中國(guó)是全球范圍內(nèi)食管癌的高發(fā)區(qū)，歐美國(guó)家的食管癌則以腺癌為主，而中國(guó)的食管癌以鱗狀細(xì)胞癌為主，兩者的發(fā)生機(jī)制存在差異[5-6]。因此食管癌沒有像其他惡性腫瘤一樣在世界各國(guó)的廣泛研究下，驅(qū)動(dòng)基因及靶向藥物迅速被發(fā)現(xiàn)。食管鱗狀細(xì)胞癌的研究主要依賴包括中國(guó)在內(nèi)的一些亞洲國(guó)家，發(fā)展相對(duì)緩慢，至今未發(fā)現(xiàn)特異的驅(qū)動(dòng)基因及靶向藥物。導(dǎo)致中國(guó)食管癌患者的預(yù)后在過(guò)去的幾十年，并未隨醫(yī)療條件和衛(wèi)生水平的提高而得到大幅的改善。

Hippo信號(hào)通路作為腫瘤抑制信號(hào)通路，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，它可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖來(lái)精確地控制器官的大小[7]。在哺乳動(dòng)物，Hippo通路的調(diào)節(jié)功能得到進(jìn)一步發(fā)揮。其組成控件包括MST1/2、Last1/2和Mob1等；而TAZ則是這條通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。TAZ是具有PDZ結(jié)構(gòu)域的致瘤因子[8]，它的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌等多種腫瘤有關(guān)[9]。正常情況下，當(dāng)Hippo通路活化時(shí)，TAZ被磷酸化，潴留于細(xì)胞質(zhì)中，最終被降解。TAZ過(guò)表達(dá)時(shí)，過(guò)多未被磷酸化的TAZ進(jìn)入細(xì)胞核，特異性地結(jié)合一系列的轉(zhuǎn)錄因子，如TEAD、TTF-1、Pax-8、Pax-5、TBX5等[10]，從而促進(jìn)細(xì)胞的增生，抑制凋亡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。此外，TAZ的功能與心臟、肌肉、骨骼、脂肪等組織的發(fā)育密切相關(guān)。近年有研究顯示TAZ可以調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化，降低細(xì)胞間的黏附性，促進(jìn)EMT[11]。

本組免疫組化結(jié)果表明，TAZ蛋白在食管癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且食管癌與癌旁組織中EMT相關(guān)因子(表皮相關(guān)因子E-cadherin、CKpan和間質(zhì)相關(guān)因子vimentin)的表達(dá)差異均有顯著性，且與E-cadherin、CKpan的表達(dá)呈正相關(guān)，與vimentin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，E-cadherin陰性患者腫瘤分期較晚(以Ⅲ+Ⅳ為主)，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。表明食管癌組織中存在EMT現(xiàn)象，EMT可能促進(jìn)食管癌的進(jìn)展。TAZ陽(yáng)性患者腫瘤分化程度較低，分期較晚，并且TAZ的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)，TAZ陽(yáng)性患者腫瘤分期較晚，表明TAZ可能也參與食管癌的EMT過(guò)程，使食管癌更易發(fā)生侵襲。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TAZ可促進(jìn)EMT轉(zhuǎn)化，使腫瘤更具侵襲性。EMT的過(guò)程也是腫瘤由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示食管癌中TAZ和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)具有一定的相關(guān)性，其中可能存在某些共同的通路，具體機(jī)制還有待于更深入的分析。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法，檢測(cè)143例食管癌及相應(yīng)癌旁組織中TAZ蛋白、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示食管癌組織中TAZ蛋白高表達(dá)。TAZ蛋白的表達(dá)與患者分期晚有關(guān)，且與EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)有一定的相關(guān)性，表明TAZ可能參與食管癌的EMT過(guò)程，共同促進(jìn)食管癌的發(fā)展、侵襲。

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