卵巢癌中g(shù)C1qR的表達及其凋亡機制

王 偉，紀 捷，程 雪，張靜敏，郭凌川

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率位居第3位，病死率位居首位，近年其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。目前，卵巢腫瘤細胞減滅術(shù)加輔助化療是晚期卵巢癌的規(guī)范性治療方案，但治療過程中易出現(xiàn)卵巢癌細胞的原發(fā)性和獲得性多藥耐藥現(xiàn)象。球狀C1q受體(gC1qR)屬于線粒體膜蛋白，具有多重生物學(xué)功能，在機體抗感染、炎癥、細胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[2]。本文著重探討gC1qR基因在卵巢癌中的表達及其生物學(xué)意義，為臨床和病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1材料收集2013年6月～2016年5月南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院診治的48例卵巢癌患者，經(jīng)病理學(xué)確診，臨床資料完整?；颊吣挲g33～67歲，平均(52.1±14.2)歲；漿液性囊腺癌35例，黏液性囊腺癌12例，子宮內(nèi)膜樣癌1例。另收集癌旁組織48例無癌細胞浸潤作為對照。所有標(biāo)本取材后均置于-79 ℃保存。

1.2試劑及儀器MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；T4DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶由Invitrogen公司提供；Trizol、Taq DNA酶、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、Oligo(dT)15及dNTPs購自美國Sigma公司；gC1qR和β-actin基因引物由上海博亞公司合成。Prime 7300熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3卵巢癌細胞培養(yǎng)卵巢癌細胞株SKOV3由杭州赫貝公司提供。卵巢癌細胞株SKOV3接種于含有10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察，待細胞貼壁生長，3天后換液，除去非貼壁細胞。當(dāng)卵巢癌細胞布滿瓶底時，可繼續(xù)傳代。

1.4RT-PCR檢測取100 mg腫瘤組織研磨成粉末后加入定量Trizol。按常規(guī)提取總RNA，以β-actin為內(nèi)參照進行g(shù)C1qR的定量檢測，gC1qR引物與探針的設(shè)計是根據(jù)GenBank上gC1qR cDNA序列，其上游序列：5′-AATCACACGGTAGACACTGAAATGCC-3′，下游序列為：5′-CATCATCCCATCTAAAATGTCCCCTG-3′，探針序列：5′-TGCTCCAGTTCAACCAACGTCCTTCTC-3′。β-actin引物上游序列：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3′，下游序列：5′-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATA-3′，探針序列：5′-ACGCGCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-3′。PCR反應(yīng)體系在ABI Prime 7300定量PCR檢測儀，參數(shù)設(shè)為50 ℃ 2 min、95 ℃ 5 min、95 ℃ 20 s、60 ℃ 2 min，33個循環(huán)，單點熒光在60 ℃進行檢測。選擇FAM熒光檢測模式，對于實驗數(shù)據(jù)，以下公式進行計算：2-ΔΔCT=2-(CT.gC1qR-CT.actin)Time x+(CT.gC1qR-CT.actin)Time 0。

1.5gC1qR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與分組將培養(yǎng)的卵巢癌細胞分為3組，分別為pcDNA3.1-gC1qR載體、pcDNA3.1空載體及不經(jīng)任何處理的空白組。轉(zhuǎn)染前將0.8 μg質(zhì)粒DNA稀釋在50 μL Opti-MEM液體中，充分混勻，室溫放置5 min；將2.0 μL Lipofectamine稀釋在50 μL Opti-MEM液體中，充分混勻，室溫放置10 min。將上述兩種液體混合，室溫放置30 min，將混合液分別加入卵巢癌細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)6～8 h，換液，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以pcDNA3.1載體中的綠色熒光蛋白(GFP)的表達判斷質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，確定最佳收獲卵巢癌細胞的時間。

1.6Westernblot法檢測取卵巢癌組織剪碎加入細胞裂解液均勻裂解，以1 500 r/min離心5 min，取上清液定量，備用。每個標(biāo)本取100 μg總蛋白上樣置于SDS-PAGE膠的樣孔內(nèi)，進行電泳。目的蛋白被適當(dāng)分離后，將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜放入含5%的脫脂奶粉TBS中封閉2 h；加入5%脫脂奶粉稀釋一抗，搖床上37 ℃孵育4 h，以TBS洗3次，每次15 min，加入HRP結(jié)合的二抗(購自Cell Signaling公司)，37 ℃孵育1 h。TBST洗滌后，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。以Bio-Rad凝膠成像分析儀，對印跡條帶進行灰度掃描，采用以下公式計算：目的蛋白/內(nèi)參蛋白。

1.7免疫組化染色所有組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，免疫組化采用SP法染色。微波抗原修復(fù)后，依次加入3%過氧化氫和正常非免疫動物血清封閉，溫育15 min；滴加一抗50 μL，4 ℃過夜；PBS沖洗，加二抗(購自美國Santa Cruz公司)37 ℃，1 h，DAB顯色并適時終止，蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸甲醇分化后脫水，透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。免疫組化結(jié)果判斷以細胞質(zhì)內(nèi)有棕褐色顆粒為陽性。

1.8卵巢癌細胞線粒體功能檢測

1.8.1卵巢癌細胞內(nèi)活性氧(ROS)的測定 將卵巢癌細胞接種至6孔培養(yǎng)板，實驗如上述分組，卵巢癌細胞培養(yǎng)至指定時間，加入終濃度為10 μmol/L H2DCFDA孵育20 min，經(jīng)37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中靜置0.5 h，以PBS洗滌細胞3次；倒置熒光顯微鏡檢測細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生(激發(fā)光488 nm、發(fā)射光530 nm)，以對照組的熒光強度作為細胞內(nèi)ROS水平。

1.8.2卵巢癌細胞內(nèi)線粒體膜電位的測定 將卵巢癌細胞接種至6孔培養(yǎng)板，實驗如上述分組，卵巢癌細胞培養(yǎng)至指定時間，加入終濃度為10 μmol/L的JC-1，37 ℃ 20 min；熒光顯微鏡下檢測JC-1單體時的變化(激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm)，以對照組的熒光強度作為細胞內(nèi)線粒體膜電位。

1.8.3卵巢癌細胞線粒體內(nèi)Ca2+測定 將卵巢癌細胞消化，PBS液重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清；用PBS重懸細胞1～2 mL，加入Fluo-3/AM-DMSO，調(diào)整終濃度為5 μmol/L，混勻，37 ℃避光孵育45 min；1 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS調(diào)整細胞濃度為每毫升1×106個細胞，流式細胞儀檢測。

1.9卵巢癌細胞增殖活性的測定MTT比色法：用含10%胎牛血清配成單個細胞懸液，接種至96孔板；5%CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄上清。每孔加DMSO 150 μL，震蕩10 min，采用OD 490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的吸光度值，以時間為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制卵巢癌細胞生長曲線。

1.10卵巢癌細胞遷移的測定采用Transwell實驗，實驗前將卵巢癌細胞饑餓24 h，用含BSA的無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為每毫升5×105個細胞。取卵巢癌細胞懸液100 μL置于Transwell小室，小室下室加入600 μL含20%FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，以0.1%結(jié)晶紫染色20 min，通過細胞染色，顯微鏡下直接計數(shù)“貼壁”細胞，計算卵巢癌細胞的遷移能力。

1.11卵巢癌細胞凋亡檢測取對數(shù)生長期的卵巢癌細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清。PBS充分洗滌細胞2次，用250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞。取100 μL的細胞懸液重懸細胞，加入5μL Annexin FITC和10 μL的PI溶液，室溫避光孵育30 min。加入400 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)流式細胞儀分析檢測。采用激發(fā)光488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。

2 結(jié)果

2.1卵巢癌組織中g(shù)C1qR的表達PCR檢測結(jié)果顯示，42例(87.5%)卵巢癌組織中g(shù)C1qR mRNA表達水平下調(diào)，癌旁組織中3例(6.25%)gC1qR mRNA表達水平下調(diào)(P<0.001)；同期以Western blot法檢測gC1qR蛋白表達，結(jié)果顯示44例(91.7%)卵巢癌組織中蛋白表達水平下調(diào)，而癌旁組織中僅5例(10.4%)蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖1)；采用免疫組化SP法檢測gC1qR蛋白，其主要表達于細胞質(zhì)中；gC1qR基因在卵巢癌組織中的表達明顯低于其相應(yīng)的癌旁組織，兩者差異具有顯著性(P<0.05)。

圖1 gC1qR 蛋白表達

2.2卵巢癌細胞株SKOV3的形態(tài)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

2.2.1光學(xué)顯微鏡形態(tài) 卵巢癌細胞形態(tài)為多角形或短梭形，胞核居中呈圓形或橢圓形，核仁多為2～3個。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)至48 h，pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，卵巢癌細胞形態(tài)變小、變圓，胞質(zhì)回縮，細胞間隙顯著增大，細胞核變小、變圓，細胞質(zhì)相對較大，核質(zhì)比例變小，核仁數(shù)量顯著減少，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，貼壁生長的細胞數(shù)量明顯減少，溶解與死亡的細胞數(shù)目顯著較多，伴隨出現(xiàn)大量細胞溶解碎片?？蛰d體組與PBS組，細胞排列密集，間隙小，細胞形態(tài)正常，核質(zhì)比大，核仁多見，兩者形態(tài)無明顯差異。

2.2.2透射電鏡形態(tài) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，觀察pcDNA3.1空載體組顯示，細胞核質(zhì)比較大，核仁多為2～3個，且體積較大，細胞表面有大量微絨毛，與PBS組比較，細胞形態(tài)基本正常，無顯著改變。觀察pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒組顯示，細胞形態(tài)出現(xiàn)顯著改變：細胞表面微絨毛明顯減少，細胞質(zhì)體積相對增大，出現(xiàn)大量空泡，部分細胞器變性，形成凋亡小體，細胞核邊緣化，核凝縮并發(fā)生斷裂，細胞核內(nèi)染色質(zhì)增多且邊緣化(圖2)。

2.2.3細胞免疫熒光 將培養(yǎng)的SKOV3細胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒和pcDNA3.1空載體，綠色熒光為系統(tǒng)指示標(biāo)記熒光，藍色熒光為gC1qR蛋白表達，48 h后熒光顯微鏡觀察顯示，與PBS組比較，pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒組，藍色熒光表達量顯著增多，且主要富集于細胞質(zhì)中；而與pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒組比較，pcDNA3.1空載體組，藍色熒光表達量顯著減少(圖3)。

2.2.4gC1qR蛋白的表達 實驗結(jié)果表明，pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒組蛋白表達水平顯著升高，其升高分別為pcDNA3.1空載體組與PBS組的5.06倍(P<0.001)和3.34倍(P<0.001)；pcDNA3.1空載體組與PBS組之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3卵巢癌細胞SKOV3的生物學(xué)功能檢測

2.3.1gC1qR基因?qū)KOV3細胞增殖及凋亡的影響 MTT法實驗結(jié)果表明，與PBS組比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒48 h，SKOV3細胞增殖率呈顯著下降，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而pcDNA3.1空載體組與PBS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Transwell實驗數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒48 h后，發(fā)生遷移的SKOV3細胞數(shù)量僅為PBS組的47.3%，兩組比較差異有顯著性(P<0.01)，而pcDNA3.1空載體作用于卵巢癌細胞，實驗結(jié)果顯示與PBS組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

②A②B②C③A③B③C

圖2SKOV3細胞超微結(jié)構(gòu)：A.pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒；B.pcDNA3.1空載體；C.PBS組圖3SKOV3細胞熒光定位：A.pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒；B.pcDNA3.1空載體；C.PBS組

流式細胞技術(shù)檢測所得數(shù)據(jù)表明，與PBS組比較，pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒組卵巢癌細胞凋亡數(shù)量顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與PBS組相比，pcDNA3.1空載體組卵巢癌細胞凋亡數(shù)量未見明顯增多，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

圖4 SKOV3細胞凋亡檢測

2.3.2gC1qR基因?qū)KOV3細胞線粒體功能的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，透射電鏡觀察卵巢癌細胞線粒體形態(tài)的改變。pcDNA3.1空載體組與PBS組電鏡下可見卵巢癌細胞線粒體形態(tài)基本正常，無顯著改變，線粒體嵴清晰可見；gC1qR基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組電鏡下可見線粒體形態(tài)發(fā)生顯著改變，線粒體嵴斷裂、消失、基質(zhì)呈疏松狀態(tài)，部分線粒體明顯腫脹，圍繞在細胞核周圍呈密集排列，小部分線粒體甚至呈空泡狀(圖5)。

本實驗檢測線粒體的功能指標(biāo)：PCR對線粒體拷貝數(shù)進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PBS組相比，gC1qR基因過表達可顯著減少線粒體拷貝數(shù)，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；pcDNA3.1空載體組卵巢癌線粒體拷貝數(shù)與PBS組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Fluo-3/AM熒光檢測細胞線粒體內(nèi)Ca2+濃度，與PBS組相比gC1qR基因過表達，卵巢癌細胞線粒體內(nèi)Ca2+負荷顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；空載體質(zhì)粒組與PBS比較，Ca2+濃度差異無顯著性(P>0.05)。

應(yīng)用H2DCFDA、JC-1熒光探針，觀察細胞內(nèi)的ROS含量及線粒體膜電位改變。所得實驗數(shù)據(jù)表明，與PBS對照組比較，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組gC1qR基因過表達能顯著誘導(dǎo)SKOV3細胞ROS的產(chǎn)生(P<0.001，圖6)；同時，gC1qR基因過表達能顯著降低SKOV3線粒體膜電位，與PBS對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。pcDNA3.1空載體質(zhì)粒組，ROS的產(chǎn)生、線粒體膜電位與PBS組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

細胞凋亡、增殖是多細胞生物體保持細胞數(shù)量作為錨定在線粒體膜表面的gC1qR蛋白，具有多向性調(diào)節(jié)作用，如參與了細胞周期的進程、細胞的增殖、蛋白質(zhì)的加工翻譯以及細胞衰老與凋亡等生理功能[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，作為補體C1q受體，在外源性化學(xué)毒物作用下，gC1qR可介導(dǎo)單核細胞的凋亡，影響單核細胞的生物學(xué)功能[6]。文獻報道，gC1qR基因可誘導(dǎo)p53表達，致使子宮頸癌細胞凋亡[7-8]。本組實驗數(shù)據(jù)顯示，pcDNA3.1-gC1qR載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞48 h，SKOV3細胞增殖、遷移率明顯降低，而細胞的凋亡率顯著增加，且細胞呈顯著的凋亡特征；同期透射電鏡下觀察卵巢癌細胞形態(tài)有顯著改變：細胞表面微絨毛明顯減少，細胞質(zhì)體積相對增大，出現(xiàn)大量空泡，部分細胞器變性，形成凋亡小體，細胞核邊緣化，核凝縮并發(fā)生斷裂，細胞核內(nèi)染色質(zhì)增多且邊緣化；以上結(jié)果提示：gC1qR基因過表達對卵巢癌細胞的凋亡有促進作用。

ABC

圖5SKOV3細胞線粒體形態(tài)：A.pcDNA3.1-gC1qR質(zhì)粒組；B.pcDNA3.1空載體組；C.PBS組

圖6 SKOV3細胞線粒體ROS總量

動態(tài)平衡的重要生理過程[3]，因細胞凋亡有別于病理條件下細胞壞死，研究者積極探索細胞凋亡的本質(zhì)，以期發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在多種疾病中的重要作用，實現(xiàn)治療、預(yù)防疾病的臨床意義。

線粒體作為引發(fā)細胞內(nèi)源性凋亡途徑的主要執(zhí)行細胞器，應(yīng)激因素作用下，線粒體膜通透性增高，釋放的Cyt C與Apaf-1結(jié)合，激活Caspase家族引發(fā)細胞最終凋亡程序[9]。已知線粒體可以通過以下途徑實現(xiàn)細胞凋亡：(1)釋放相關(guān)的凋亡因子引發(fā)細胞凋亡；(2)損壞電子傳遞鏈，擾亂氧化磷酸化過程，抑制ATP的產(chǎn)生；(3)破壞細胞的抗氧化能力[10-11]。當(dāng)外源性物質(zhì)刺激細胞時，線粒體作為ROS產(chǎn)生的重要場所，ROS產(chǎn)生量明顯增多[12]。高水平的ROS致使線粒體損傷，進而引發(fā)線粒體膜電位的改變，釋放p21、Bax及Caspase 3等各種促凋亡因子誘導(dǎo)細胞，引發(fā)凋亡[13]。gC1qR作為錨定在線粒體上的膜蛋白，其過表達可顯著誘導(dǎo)卵巢癌上皮細胞的凋亡，同時gC1qR還能有效誘導(dǎo)卵巢癌細胞線粒體功能的改變。首先，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)gC1qR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞，其線粒體拷貝數(shù)顯著減少；且線粒體嵴斷裂、消失、基質(zhì)呈疏松狀態(tài)，部分線粒體明顯腫脹，圍繞在細胞核周圍呈密集排列，小部分線粒體甚至呈空泡狀；其次，gC1qR基因過表達，卵巢癌細胞線粒體內(nèi)Ca2+負荷顯著增多；最后，gC1qR基因可顯著誘導(dǎo)卵巢癌細胞ROS的產(chǎn)生、降低線粒體膜電位，本實驗結(jié)果與文獻報道高度一致。

綜上所述，本組結(jié)果表明，gC1qR基因在卵巢癌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，在該過程中g(shù)C1qR基因可通過引發(fā)線粒體功能障礙，誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡。

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