CXCL12/CXCR4/MMP-2信號通路對三陰型乳腺癌生物學行為的影響

焦 娟，宋艷艷，劉 霞，劉 倩，馮志寅，蘇麗萍，何鼎盛，張 巍

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤，其病死率為14%。2006年Bryan等[1]首次提出三陰型乳腺癌的概念，將ER、PR及HER-2均為陰性的乳腺癌定義為三陰型乳腺癌。該亞型乳腺癌對化療有較高敏感性，但是腫瘤侵襲能力強、進展快，缺乏內分泌治療和靶向治療，治療效果與其他亞型相比療效較差。目前，乳腺癌治療失敗的主要原因是淋巴道轉移和血行轉移，因此深入分析三陰型乳腺癌浸潤和轉移的機制，并從中尋找有效的標志物和治療靶點，對改善三陰型乳腺癌患者的治療效果和預后有重要意義。

近年趨化因子在多種腫瘤中的研究均涉及腫瘤的浸潤和轉移。CXCL12又稱基質細胞衍生因子SDF-1，是趨化因子家族中的一員，CXCL12主要與其相應的受體CXCR4結合誘導腫瘤的轉移進程。MMP-2是促進腫瘤細胞浸潤轉移的重要因子，多項研究證實MMP-2在乳腺癌中存在基因拷貝數(shù)的增加。有文獻報道[2]在前列腺癌中CXCL12/CXCR4可能通過活化MMP-2的表達促進腫瘤的浸潤，但有關 CXCL12/CXCR4和MMP-2在三陰型乳腺癌浸潤轉移中的作用報道較少。本文以人乳腺癌MDA-MB-231細胞株為分析對象，分別轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，干擾 CXCR4的表達，并檢測轉染后腫瘤細胞的增殖和遷移能力，探討CXCL12/CXCR4及MMP-2對 MDA-MB-231 細胞株增殖、遷移等生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1細胞系及主要試劑細胞系及主要試劑包括人三陰型乳腺癌MDA-MB-231細胞株細胞(由新疆醫(yī)科大學臨床醫(yī)學研究院細胞庫提供)，Trizol (Invitrogen公司，美國)，DMEM細胞培養(yǎng)液，0.25%胰酶，胎牛血清(Gibco公司，美國)，青霉素-鏈霉素雙抗(Hyclone公司，美國)，OptiMEM(Invitrogen公司，美國)，凋亡試劑盒(BD公司，美國)，Lipofectamine 3000轉染試劑盒、Negative RNAi(Life technologies公司，美國)，β-actin(Abcam公司，美國)，SYBR Select Master Mix(ABI)，pcDNA3.1(上海歐易公司，中國)。

1.2細胞培養(yǎng)將凍存于液氮中的MDA-MB-231細胞迅速取出，置于37 ℃水浴鍋使其融化。融化后取出凍存管，用乙醇消毒后開啟，用移液器將細胞轉移到15 mL離心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕輕顛倒混勻數(shù)次。以1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL含10%新生胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞。細胞計數(shù)后，將細胞液接種于干凈的培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)基，于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。當細胞密度>70%時，用胰酶按照常規(guī)方法進行傳代。取對數(shù)成長期的細胞進行實驗。

1.3細胞轉染轉染前1天，將處于對數(shù)期生長的MDA-MB-231細胞用胰蛋白酶進行消化，計數(shù)后稀釋成所需的密度，接種到相應的板孔中(保證在轉染前細胞密度約70%)，于37 ℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)過夜，陰性對照用Oligofectamine轉染試劑按照Lipofectamine 3000說明書進行轉染。實驗分為3組：實驗組(轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4)、陰性對照組(轉染陰性對照品)和空白對照組(未做轉染處理)。

1.4Westernblot實驗取細胞≥1×106個，加入500 μL RIPA裂解液，充分混勻。冰上放置30 min， 4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)凝膠進行電泳分離后，穩(wěn)壓冰浴電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育4 ℃過夜，二抗孵育后，AP法顯色，化學發(fā)光儀檢測、拍照，與內參β-actin比較，計算目的蛋白的表達豐度。

1.5RT-PCR實驗分別取2 μg總RNA，使用反轉錄引物進行逆轉錄反應，以獲得的cDNA為模板，進行qRT-PCR反應，每孔設3個復孔。引物序列如下：CXCR4上游引物：5′-GGCCCTAGCTTTCTTCCACT-3′，下游引物：5′-GAGAGGATCTTGAGGCTGGA-3′；CXCL12上游引物：5′-GGCTCCCTGTAACCTCTTCAG-3′，下游引物：5′-CAGACTCAATCCCAACACACA-3′；MMP-2上游引物：5′-GATACCCCTTTGACGGTAAGGA-3′，下游引物：5′-CCTTCTCCCAAGGTCCATAGC-3′；β-actin上游引物：5′-ATGATGATATCGCCGCGCTC-3′，下游引物：5′-TCGATGGGGTACTTCAGGG-3′。利用SYBR Green染料檢測細胞目的基因的表達，并將β-actin作為內參?？偡磻w積為20 μL，反應條件：50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min 預變性后，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s合計進行40個循環(huán)擴增。采用相對定量公式：2-△△Ct，計算細胞目的基因的相對表達量。

1.6劃痕實驗鋪板細胞培養(yǎng)12 h，使用不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h進行細胞轉染，并在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，進行細胞劃痕實驗并用DMEM完全培養(yǎng)基換液。分別在劃痕培養(yǎng)0、24、48、72 h進行拍照，計算劃痕之間細胞愈合的距離。

1.7MTT實驗檢測轉染前一天用胰酶消化收集細胞，接種于96孔板，轉染步驟同前，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩8～10 min，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定待測樣孔光吸收值，記錄結果并繪制生長曲線。

2 結果

2.1Westernblot法檢測分別轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后CXCR4、CXCL12及MMP-2蛋白的變化體外通過脂質體介導的瞬時轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，在轉染72 h后收集細胞，經(jīng)Western blot實驗檢測，CXCR4蛋白條帶在4.3×104處顯色，CXCL12蛋白在1.1×104處顯色，MMP-2蛋白條帶在7.2×104處顯色，內參β-actin蛋白條帶在4.2×104處顯色(圖1)。分析各條帶的灰度值，以β-actin蛋白為內參，對CXCR4、CXCL12及MMP-2蛋白的相對表達量進行統(tǒng)計分析，結果顯示轉染CXCR4-siRNA，CXCR4蛋白的表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，CXCL12蛋白表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，MMP-2蛋白的表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)；轉染pcDNA3.1-CXCR4后CXCR4蛋白的表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，CXCL12蛋白的表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，MMP-2蛋白表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)。

2.2RT-PCR檢測分別轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后CXCR4、CXCL12及MMP-2mRNA的變化體外通過脂質體介導瞬時轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，在轉染72 h后收集細胞，提取各組細胞中的總RNA。經(jīng)RT-PCR檢測，并通過2-△△Ct計算目的基因CXCR4、CXCL12及MMP-2 mRNA的相對表達量。結果顯示：轉染CXCR4-siRNA后CXCR4的mRNA表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，CXCL12的mRNA表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，MMP-2的mRNA表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)；轉染pcDNA3.1-CXCR4后CXCR4的mRNA表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，CXCL12的mRNA表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，MMP-2的mRNA表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01，圖2～4)。

圖1 Western blot檢測CXCR4-siRNA(A)和 pcDNA3.1-CXCR4(B)轉染MDA-MB-231細胞后CXCR4、CXCL12及MMP-2蛋白的表達

2.3劃痕實驗檢測分別轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后MDA-MB-231細胞遷移能力的變化沿6孔板的直徑均勻用力劃痕后，轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，檢測干擾CXCR4基因的表達對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響。從倒置顯微鏡中細胞劃痕的圖像可見，在轉染CXCR4-siRNA 72 h后與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組細胞間距寬于對照組，愈合距離比大于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示轉染CXCR4-siRNA后細胞的遷移能力下降，劃痕愈合遲緩，下調CXCR4基因的表達可抑制腫瘤細胞的遷移；在轉染pcDNA3.1-CXCR4 72 h后與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組細胞間距窄于對照組，愈合距離比小于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖5)，提示轉染pcDNA3.1-CXCR4后細胞的遷移能力增強，劃痕愈合加快，上調CXCR4基因的表達可促進腫瘤細胞的遷移。

圖2 RT-PCR檢測各組MDA-MB-231細胞中CXCR4 mRNA水平表達

A.轉染CXCR4-siRNA組；B.轉染pcDNA3.1-CXCR4組；**P<0.01

圖3 RT-PCR檢測各組MDA-MB-231細胞中CXCL12 mRNA水平表達

A.轉染CXCR4-siRNA組；B.轉染pcDNA3.1-CXCR4組；**P<0.01

圖4 RT-PCR檢測各組MDA-MB-231細胞中MMP-2 mRNA水平表

A.轉染CXCR4-siRNA組；B.轉染pcDNA3.1-CXCR4組；**P<0.01

圖5 細胞劃痕實驗檢測CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4轉染MDA-MB-231后細胞遷移能力變化

2.4MTT實驗檢測分別轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后MDA-MB-231細胞增殖能力的變化應用MTT法檢測各組細胞的增殖能力，結果顯示：CXCR4-siRNA 轉染MDA-MB-231細胞48、72、96 h后，實驗組細胞增殖能力較陰性對照組和空白對照組降低，其中以72 h降低最為顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陰性對照組和空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示下調CXCR4的表達能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖能力。pcDNA3.1-CXCR4轉染MDA-MB-231細胞48 、72、96 h后，實驗組細胞增殖能力與陰性對照組和空白對照組相比顯著增加，其中以72 h降低最為顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陰性對照組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖6)。提示下調CXCR4的表達能夠顯著促進MDA-MB-231細胞的增殖能力。

圖6 MTT實驗檢測轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4后細胞增殖能力的變化

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，WHO(2014)乳腺腫瘤分類的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示乳腺癌占女性腫瘤的16%，每年約50萬以上的患者死亡。其中三陰型乳腺癌占浸潤性乳腺癌的15%～20%，具有侵襲性強、病理分級高和廣泛的淋巴結轉移，且在年輕患者中更為常見[3]。與其他亞型的乳腺癌相比，三陰型乳腺癌患者在治療2～3年后發(fā)生遠處轉移和早期復發(fā)的可能性較高，患者的生存率更低。因此，立足分子水平深入分析三陰型乳腺癌的浸潤和轉移機制有重要的臨床意義。

CXCL12是趨化因子CXC亞家族成員，并在肺、肝、骨髓和淋巴結等組織中廣泛表達。研究發(fā)現(xiàn)CXCL12與其受體CXCR4結合在造血過程中發(fā)揮重要作用，即調控骨髓造血干細胞的歸巢和驅使淋巴細胞轉運至炎癥部位[4]。CXCR4是存在于細胞表面的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，在正常狀態(tài)下CXCR4多表達于白細胞、內皮和上皮細胞的表面。在腫瘤中CXCR4參與多種實體腫瘤的發(fā)生與轉移，如乳腺癌[5]、腎透明細胞癌[6]、結直腸腫瘤[7]、卵巢透明細胞癌[8]和子宮頸鱗癌[9]等，并與腫瘤的不良預后相關。有研究報道在局灶晚期乳腺癌中CXCR4過表達組腫瘤復發(fā)的相對危險度和腫瘤死亡的相關危險度均顯著高于CXCR4低表達組[10]。Holm等[11]在103例乳腺癌樣本中證實存在CXCR4過表達，并與腫瘤大小、淋巴結轉移、ER/PR及HER-2的表達差異無統(tǒng)計學意義，但CXCR4高表達且HER-2陰性的乳腺癌侵襲性更強且更易復發(fā)，CXCR4可作為評估HER-2陰性乳腺癌的侵襲性生物學行為指標。Wu等[5]研究結果顯示CXCR4在乳腺癌中的表達顯著高于癌旁正常組織，而CXCL12在兩者之間的表達差異無統(tǒng)計學意義，CXCL12在原發(fā)性乳腺癌和淋巴結轉移的乳腺癌中表達存在差異。有研究報道[12]在151例三陰型乳腺癌中有近75%的病例存在CXCR4高表達，CXCR4高表達組患者腫瘤復發(fā)和發(fā)生癌癥相關死亡原因的概率是CXCR4低表達組的6倍。

本實驗選用人三陰型乳腺癌細胞株MDA-MB-231作為分析對象，通過體外瞬時轉染技術分別轉染CXCR4-siRNA和pcDNA3.1-CXCR4，干擾CXCR4的表達，并通過Western blot和RT-PCR檢測轉染效果，結果顯示CXCR4在蛋白水平和mRNA水平的表達均發(fā)生相應改變，證實轉染有效。繼而從細胞增殖、遷移運動能力以及MMP-2表達變化等方面探討CXCL12/CXCR4信號通路與MMP-2的關系，以期為三陰型乳腺癌浸潤轉移的阻斷治療提供理論基礎。

CXCR4除誘導白細胞的遷移，還是B淋巴細胞生成和骨髓生成所必需的誘導因子，CXCR4通過與CXCL12相互作用，誘導造血干細胞細胞骨架的重排，增加細胞之間的黏附，誘導它們遷移至特定的器官，并促進腫瘤細胞增殖，直接或以旁分泌的方式促進血管生成，最終形成轉移性腫瘤[13]。間質的成纖維細胞構成乳腺癌細胞微環(huán)境的主要部分，研究報道腫瘤相關成纖維細胞(并非正常的乳腺成纖維細胞)中CXCL12呈高表達[14]，CXCL12的表達通過直接增強腫瘤細胞生長和通過招募腫瘤血管生成所需的內皮祖細胞，促進乳腺癌的浸潤和轉移。

本組在MTT實驗和細胞劃痕實驗中發(fā)現(xiàn)，下調CXCR4表達，乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖和遷移能力受到明顯抑制；而上調CXCR4表達，乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖和遷移能力明顯增強，表明腫瘤中CXCR4表達的增加會刺激腫瘤細胞的增殖和侵襲性，并可能與間質腫瘤相關成纖維細胞中的CXCL12共同作用，改變腫瘤的微環(huán)境，進而促進腫瘤的浸潤轉移。

細胞外基質的降解在腫瘤的浸潤和侵襲過程中起重要作用，其中細胞外基質的降解主要依靠蛋白水解酶，MMP是蛋白水解酶中較為重要的一類，MMP-2是最主要的降解細胞外基質的水解酶。本實驗結果顯示MDA-MB-231細胞轉染CXCR4-siRNA后MMP-2的表達降低，而轉染pcDNA3.1-CXCR4后MMP-2表達上調，提示三陰型乳腺癌MDA-MB-231細胞中CXCR4誘導MMP-2的活化，進而促進腫瘤的浸潤轉移。這與CXCR4/MMP-2在前列腺癌[2]、肺癌和甲狀腺癌[15-16]浸潤轉移中的研究結果一致，但具體機制仍有待進一步分析。

綜上所述，在三陰型乳腺癌中存在CXCL12/CXCR4/MMP-2信號通路的激活，下調CXCR4可以抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，還需深入探討三陰型乳腺癌浸潤轉移的分子機制。

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