小花玄參化學成分及總黃酮含量的測定

宋玲玲,董曉娟,苗鐵錚

（延安大學 創(chuàng)新學院,陜西 西安 710100）

前 言

小花玄參是一種原產(chǎn)于中國四川、青海、甘肅的草本植物，具有與同科同屬如玄參相似的化學成分，因此應該也有類似的藥用價值。小花玄參分布極廣，資源豐富，尚未被開發(fā)利用，具有較高的經(jīng)濟發(fā)展?jié)摿1]。總黃酮是中藥特別是解熱鎮(zhèn)痛類中藥的重要成分，現(xiàn)代醫(yī)學研究證實其具有消炎、抑菌、抗腫瘤、降血糖、增強腦缺氧缺血等作用[2]。研究總黃酮提取工藝及化學成分具有重要意義。但目前有關于小花玄參的研究較少，本次研究嘗試測定小花玄參化學成分，測定總黃酮含量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采集自然野生比較成熟的小花玄參，經(jīng)鑒定后自然晾曬干重量500g左右。

1.2 儀器與試劑

精密電子天平、各種速度的離心機、標準篩、高速粉碎機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、恒溫水浴鍋、超聲波清洗機。紫外線可見分光光度計、高壓液相色譜儀、色譜數(shù)據(jù)工作站、Peakview 1.2數(shù)據(jù)處理工作站，SIMCA-P13.0數(shù)據(jù)處理軟件等。試劑：乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、蘆丁對照品、二苯乙烯苷、標準對照品，亞硝酸鈉，氫氧化鈉溶液，硝酸鋁等。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

清水清洗，去泥，恒溫干燥箱30℃至恒重，粉碎，攪拌，烘箱中60℃烘干至恒重，或采用超聲粉碎機直接粉碎，獲得粉末，過4號篩。

1.3.2 提取工藝

進行交聯(lián)實驗，取粉末每份100g,分別采用超聲提取法、連續(xù)回流法、冷浸法提取，結(jié)果顯示提取率分別為0.9%、1.1%、0.7%、0.53%。故首選連續(xù)回流法提取，以提高提取率。而后進行針對溶劑類型（甲醇、乙醇、丙酮）、濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、 回 流 時 間（30min、60min、90min、120min、150min）、回流次數(shù)（1、2、3 次）、水溫（60℃、70℃、80℃、90℃）五個變動參數(shù)，進行正交試驗。獲得濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收，加入離子水，冷凍除渣，重復2次，乙醚萃取，水層濃縮干燥，精密稱量初提物，共進行了28次正交試驗。試驗后，進行變量分析，結(jié)果顯示最佳的提取方式為：70%甲醇為溶劑，回流時間120min，回流2次，提取溫度80℃，紫外線可見分光光度計結(jié)果顯示510nm達到最大的吸光度。提取液作為總黃酮的監(jiān)測。同時采用乙醇提取液、石油醚提取液，前者作為強心苷的監(jiān)測，后者用于甾體類、三萜類物質(zhì)的檢測。

1.3.3 各類成分

各類成分的檢測定性分析采用配置手冊[3,4]。

1.3.4 檢測

（1）總黃酮含量的：①取過篩的粉末，70%甲醇為溶劑，回流時間120min，回流2次，提取溫度80℃，回收溶劑，干燥后70%乙醇溶解作為供試液；②以干燥恒重2mg蘆丁對照品＋70%乙醇制得0.1mg/mL溶液；③分別取3mL對照品溶液、供試品溶液，依次加入0.3mL的5%亞硝酸鈉、0.3mL的10%硝酸鋁、4mL的氫氧化鈉溶液，每次搖勻后靜置6min，然后再添加下一種試劑，添加70%乙醇稀釋至10mL刻度，搖勻，靜置15min，在400～720nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，測定最大吸收波長；④繪制標準曲線，準確稱取對照品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，同法操作，在510nm長度下測定吸光度，以橫坐標數(shù)字為濃度c，以吸光度A作為縱坐標，建立線性回歸方程；⑤最后進行精密度、回收率、穩(wěn)定性試驗，精密度實驗采用同一份供試品溶液，連續(xù)進樣5次，結(jié)果顯示精密度、穩(wěn)定性相對保留時間 RSD（%）分別為 0.126、1.05，均小于 3%，說明儀器的精密度符合要求，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗，相對保留時間RSD（%）均小于3%，說明穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好。總黃酮含量=[（c×V×N）×10-3/m]×100%，其中c為比色管測定溶液中的總黃酮濃度（g/L），V為比色管測定溶液體積（mL）,N為稀釋倍數(shù)，m為小花玄參粉末的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

對照品濃度c與吸光度A存在線性關系，A=2.264c-0.025，r=0.984，線性范圍 0.020～0.15mg/mL，呈現(xiàn)高度線性相關。而后進行6次重復檢驗，總黃酮含量分別為5.904%、5.587%、5.830%、5.714%、5.671%、5.518%，相對標準差2.510%，RSD%=2.46%＜3%，精密度良好。留置24h，隨機檢測，結(jié)果顯示吸光度RSD%=0.884%，提示總黃酮在供試品中的含量非常穩(wěn)定，吸光度穩(wěn)定。重復性檢測RSD%=1.16%，重現(xiàn)性檢驗效果較好。平均回收率為99.99%，回收率較高。

表1 總黃酮對照品濃度c與吸光度A線性分析Table 1 The linear analysis of concentration （c） and absorbance（A）of total flavonoids reference substance

對于得到的分離液體，試驗顯示樣本中分離的化合物包括三萜類、甾體、揮發(fā)油物質(zhì)，進行進一步分析，包括熔點、波譜解析，確認了一種物質(zhì)—烏蘇酸。對于獲得的黃酮類物質(zhì)，干燥后為淡黃色、灰白色混合針狀結(jié)晶，熔點111～163℃。

3結(jié) 論

本次研究嘗試構(gòu)建了小花玄參總黃酮物質(zhì)提取的方法，結(jié)果顯示最佳的提取條件為70%甲醇為溶劑，回流時間120min，回流2次，提取溫度80℃。最終提取的物質(zhì)，再根據(jù)對照品，進行總黃酮的檢測，便能夠測出小花玄參的含量。

對小花玄參進行了化學成分的定性、總黃酮含量分析，總黃酮濃度c與吸光度A存在線性關系，A=2.264c-0.025，r=0.984，線性范圍 0.020～0.15mg/mL，精密度、穩(wěn)定性相對保留時間RSD（%）分別為2.46%、1.16%，回收率99.99%,具有一定的參考價值，初步鑒定出烏蘇酸，后續(xù)需要分析其他物質(zhì)的含量。

［1］ 包錦淵,盧群林,溫馨,等．小花玄參中微量金屬元素分析［J］．分子科學學報,2014,30（4）:299～303．

［2］ 包錦淵,李軍喬．響應面法優(yōu)化小花玄參總皂苷提取工藝研究［J］．食品科技,2015,40（11）:213～220．

［3］ 宣偉．黃酮類化合物的研究進展［J］．中國林副特產(chǎn),2017（1）:66～69．

［4］ 吳立軍．天然藥物化學實驗指導［M］北京:人民衛(wèi)生出版社,2011．