原發(fā)性開角型青光眼視網(wǎng)膜纖維層厚度、視野缺損與房水中sCD44濃度的相關(guān)性研究

劉思彤，吳志鴻

原發(fā)性開角型青光眼（primary open angle glaucoma,POAG）是一種常見的以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinalganglial cells, RGC）選擇性死亡導(dǎo)致的以視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層（retinal nerve fiber layer, RNFL）缺損和視野缺損為特征的視神經(jīng)退行性疾病[1]，是目前常見的致盲性眼病之一，占青光眼發(fā)病率的60%～70%[2]，迄今發(fā)病機(jī)制尚未明確。除了傳統(tǒng)觀念的機(jī)械壓力學(xué)說和血管缺血學(xué)說，細(xì)胞因子也通過多種途徑參與到RGC的凋亡過程[3]。國內(nèi)外研究表明，POAG患者房水中存在較高濃度的可溶性CD44（soluble CD44, sCD44）分子，且其濃度明顯高于正常人和原發(fā)性閉角型青光眼患者[4,5]。Nolan等[6]研究發(fā)現(xiàn)sCD44與POAG患者的視野丟失有關(guān)；Knepper等[4,7]研究發(fā)現(xiàn)，POAG患者中sCD44具有細(xì)胞毒性，可抑制體外培養(yǎng)人眼小梁網(wǎng)細(xì)胞（human trabecular meshwork, HTM）和RGC的生長，其在POAG中的等電點(diǎn)明顯不同于其他類型青光眼，是POAG的一個生物學(xué)特征。本研究旨在探討POAG患者視網(wǎng)膜視盤周圍RNFL厚度及視野缺損程度與房水中sCD44濃度的相關(guān)性，以期進(jìn)一步探索POAG發(fā)病原因及機(jī)制，并為POAG治療提供新的靶點(diǎn)。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2015-07至2017-05就診于武警總醫(yī)院眼科的POAG患者40例（40眼）為研究對象（觀察組），其中男17例，女23例，年齡45～70歲，平均（55.47±10.52）歲。按視野平均缺損程度（mean defect,MD）分成A組（MD≤－6 dB，n=14眼）、B組（－6 dB＜MD＜－12 dB，n=17眼）、C組（MD≥－12 dB，n=9眼）三組。同時選取同期手術(shù)，且年齡相匹配的白內(nèi)障患者20例（22眼）為對照組，包括男9例，女11例，年齡52～70歲，平均（58.39±5.85）歲。本研究由武警總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得患者知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) POAG納入標(biāo)準(zhǔn)： 經(jīng)臨床診斷為POAG的患者，采用全國青光眼學(xué)組提出的標(biāo)準(zhǔn)：（1）眼壓＞21 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；（2）青光眼性視乳頭損害和RNFL缺損；（3）青光眼性視野缺損；（4）前房角開放。具有以上四項(xiàng)或具有1、4項(xiàng)與2或3者才診斷為POAG。白內(nèi)障對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后視力或矯正視力≥0.6，屈光度≤±2.50 D；（2）Goldmann壓平眼壓計(jì)測量眼壓≤21 mmHg；（3）視盤C/D＜0.6，雙眼C/D值差≤0.2；（4）無青光眼家族史；（5）視野檢查無異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾??；（2）曾經(jīng)歷內(nèi)眼手術(shù)和眼部外傷；（3）有視網(wǎng)膜和視神經(jīng)病變者；（4）有影響免疫的藥物用藥史；（5）不能進(jìn)行光學(xué)相干斷層成像（optical coherence tomography, OCT）檢查者；（6）不同意參與本研究者。

1.3 方法

1.3.1 一般檢查 所有研究對象均接受全面詳細(xì)的眼科檢查，包括最佳矯正視力，裂隙燈檢查，眼壓測量，眼底檢查，測量眼軸、前房深度及角膜中央厚度。同時均接受全身的基本檢查包括心率、血壓及病史詢問。每次檢查均由同一醫(yī)師完成。

1.3.2 視野檢查 采用全自動視野機(jī)的閾值檢測程序中的中心視野24-2程序進(jìn)行視野檢查，利用SIT A-Fast統(tǒng)計(jì)分析策略計(jì)算視野MD；采用紅外攝像儀自動監(jiān)測受檢眼的固視狀態(tài)。檢查前對患者進(jìn)行指導(dǎo)并預(yù)習(xí)操作，檢查均由有經(jīng)驗(yàn)的同一檢查者完成。其中，POAG組均于首次就診時檢查，白內(nèi)障對照組均于術(shù)后第二周復(fù)查時進(jìn)行視野檢查。

1.3.3 OCT檢查 采用德國ZEISS視網(wǎng)膜光學(xué)相干斷層掃描儀進(jìn)行OCT檢查，RNFL掃描以視乳頭為中心，檢查參數(shù)為：激光波長840 nm，軸向分辨率5 μm，橫向分辨率15 μm，掃描深度2 mm，掃描長度12 mm，直徑3.45 mm，獲取視盤周圍RNFL的厚度，選取信號強(qiáng)度在40分以上，圖像清晰，無斷層的圖片。檢查均由有經(jīng)驗(yàn)的同一檢查者完成。

1.3.4 房水樣本的采集與保存 房水采集于手術(shù)中進(jìn)行，嚴(yán)格按照無菌操作原則，用1 ml注射器于透明角膜緣穿刺進(jìn)入前房，緩慢抽取房水樣本50～100 μl，注入0.5 ml經(jīng)消毒干燥的Eppendorf管中并作標(biāo)記，迅速置于－80 ℃冰箱保存。

1.3.5 sCD44濃度測定 采用雙抗體夾心免疫酶聯(lián)吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）測定房水樣本中sCD44的濃度。根據(jù)人sCD44 ELISA試劑盒（北京科諾迪有限公司）的監(jiān)測范圍，把房水樣本按比例稀釋后加入樣本孔，試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔，每孔50 μl。除空白孔外均加入檢測抗體100 μl后按照操作步驟在全自動酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各孔光密度（optical density, OD）值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，組間比較采用Person χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布且方差齊，以x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析視野MD及RNFL厚度與sCD44濃度的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 觀察組與對照組在性別、年齡、眼軸方面的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性；但觀察組的眼壓、杯盤比、視野MD均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 兩組房水中sCD44濃度的比較 觀察組房水中sCD44平均濃度為（217.17±25.36）ng/L，顯著高于對照組的（137.94±16.55）ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=－13.17，P＜0.001）。A、B、C三個亞組中 POAG 患者與對照組房水中sCD44濃度比較結(jié)果見表2，經(jīng)單因素方差分析各組sCD44濃度不全相同（F=197.38，P＜0.001）；進(jìn)一步行LSD-t檢驗(yàn)，A、B、C三組房水中sCD44濃度均較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、B、C三組房水中sCD44濃度依次升高，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 原發(fā)性開角型青光眼患者與白內(nèi)障患者一般資料的比較

表1 原發(fā)性開角型青光眼患者與白內(nèi)障患者一般資料的比較

注：觀察組為原發(fā)性開角型青光眼患者，對照組為白內(nèi)障患者；MD，平均缺損；1 mmHg=0.133 kPa

組別 例數(shù) 男/女 年齡（歲） 眼壓（mmHg） 眼軸（mm） 杯盤比 視野MD（dB）觀察組 40 17/23 55.47±10.52 29.83±6.73 24.45±0.83 0.77±0.24 －10.46±7.37對照組 20 9/11 58.39± 5.85 17.22±3.16 24.50±0.98 0.26±0.08 －1.64±0.74 t/χ2值 0.03 －1.42 10.10 －0.21 1.94 －7.50 P值 0.85 0.16 ＜0.001 0.840 ＜0.001 ＜0.001

2.3 兩組視盤周圍RNFL厚度的比較 觀察組視盤周圍RNFL平均厚度為（86.02±17.03）μm，顯著低于對照組的（117.98±11.38）μm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.65，P＜0.001）。觀察組內(nèi)A、B、C三個亞組與對照組視盤周圍RNFL厚度比較見表2，經(jīng)單因素方差分析各組RNFL厚度不全相同（F=135.96，P＜0.001）；進(jìn)一步行LSD-t檢驗(yàn)，A、B、C三組RNFL厚度均較對照組變薄，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、B、C三組RNFL厚度依次變薄，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05）。

表2 原發(fā)性開角型青光眼患者與白內(nèi)障患者視野MD、RNFL厚度及房水中sCD44濃度比較

表2 原發(fā)性開角型青光眼患者與白內(nèi)障患者視野MD、RNFL厚度及房水中sCD44濃度比較

注：觀察組為原發(fā)性開角型青光眼患者，對照組為白內(nèi)障患者；MD，平均缺損；sCD44，可溶性CD44；RNFL，視神經(jīng)纖維層;與對照組相比，①P＜0.05；與A組相比，②P＜0.05；與B組相比，③P＜0.05

組別 例數(shù) 視野MD（dB） sCD44 濃度（ng/L）視盤RNFL厚度（μm）對照組 22 －1.37±0.60 137.94±16.55 117.98±11.38觀察組A組 14 －5.03±0.49① 189.14±16.71① 98.56± 7.52①B組 17 －8.82±1.70①② 224.17± 7.48①② 87.07±11.65①②C組 9 －22.82±5.46①②③ 247.55± 7.29①②③ 64.54± 8.61①②③F值 199.64 197.38 135.96 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 兩組房水樣本中sCD44濃度與視野MD及RNFL厚度相關(guān)性分析 對兩組房水樣本中sCD44濃度與視野MD行Spearman秩相關(guān)分析（圖1），結(jié)果顯示：房水中sCD44的濃度與視野MD值呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=－0.916，P＜0.05）。對兩組房水樣本中sCD44濃度與視盤周圍RNFL厚度行Spearman秩相關(guān)分析（圖2），結(jié)果顯示：房水中sCD44的濃度與視盤周圍RNFL厚度值呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=－0.915，P＜0.05）。

圖1 兩組sCD44濃度與視野MD散點(diǎn)圖

圖2 兩組sCD44濃度與視盤RNFL厚度散點(diǎn)圖

3 討 論

POAG與閉角型青光眼不同，臨床表現(xiàn)多樣，無明顯癥狀，早期不易發(fā)現(xiàn)，因而具有更大的危險性[8]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，HTM與RGC的凋亡是青光眼發(fā)病的一個重要因素。青光眼的病理基礎(chǔ)主要是由RGC及其軸突的丟失，從而導(dǎo)致盤沿、視乳頭形態(tài)凹陷和RNFL的厚度發(fā)生改變，最終導(dǎo)致視野缺損甚至失明。臨床研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RGCs丟失達(dá)30%～50%時，臨床才能檢測到視功能損害，但此時已處于疾病中晚期[9]。有研究報道，當(dāng)視網(wǎng)膜光敏度下降5 dB時，RGCs丟失高達(dá)20%[10]。隨著OCT技術(shù)的發(fā)展，臨床上可通過測量RNFL的厚度對青光眼患者進(jìn)行早期診斷[11]，并有研究證明RNFL厚度的改變與視野缺損對POAG的診斷具有一致性[12]，但OCT的RNFL檢測對未出現(xiàn)視野缺損青光眼患者的診斷價值具有爭議。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞因子sCD44在POAG發(fā)病及診斷中的價值逐漸受到重視。

CD44是一種廣泛分布于多種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，其配體主要為透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA），具有促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖、黏附、發(fā)育及分化的作用。在角膜內(nèi)皮細(xì)胞、虹膜、睫狀體及小梁網(wǎng)組織中均檢測到CD44的表達(dá)。sCD44屬于黏附分子CD44家族成員之一，是由膜CD44分子外功能區(qū)受到各種因素的影響脫落形成并存在于體液中的功能片段[13]，可在房水中檢測到其表達(dá)。Miller等[14]發(fā)現(xiàn)sCD44蛋白含量在POAG患者玻璃體中的濃度明顯高出正常人3倍多。sCD44在功能上對抗CD44，與HTM表面CD44競爭結(jié)合HA，從而干擾細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而參與POAG的發(fā)病過程[15,16]。此外，CD44是線粒體發(fā)揮功能的必要蛋白，sCD44競爭成為線粒體內(nèi)蛋白使線粒體嵴斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡也可能是引起POAG的機(jī)制之一[17]。Choi等[18]研究發(fā)現(xiàn)POAG中sCD44具有細(xì)胞毒性，可作用于體外培養(yǎng)人眼TM和RGC，抑制細(xì)胞的生長。凌云與劉海霞[19]研究指出sCD44的生物利用度不僅依賴HA，且這種結(jié)合力受眼壓影響，隨著眼壓升高，HA聚合物發(fā)生變化，與sCD44結(jié)合力降低，游離的sCD44濃度升高，一旦超過臨界值，就會對靶細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。sCD44在POAG中的等電點(diǎn)明顯不同于其他類型青光眼，低磷酸化sCD44的出現(xiàn)及其濃度的升高是POAG及正常眼壓性青光眼的特異性指標(biāo)。本研究也證實(shí)了POAG患者中sCD44濃度平均較對照組明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

盡管國內(nèi)外研究都表明，POAG患者房水中存在較高濃度的sCD44，且其濃度明顯高于正常人和原發(fā)性閉角型青光眼患者，但房水中sCD44的濃度與視野損害程度及視盤RNFL厚度的相關(guān)性研究報道較少。本研究結(jié)果顯示，POAG患者房水中sCD44的濃度與視野MD及視盤RNFL厚度均呈顯著負(fù)相關(guān)，隨著sCD44濃度的升高，視野MD逐漸變大，視盤RNFL厚度逐漸變薄，說明房水中sCD44濃度與視野MD及RNFL有關(guān)，即sCD44濃度與POAG病程相關(guān)，其濃度越高，RNFL及視野的損害越嚴(yán)重，這與文獻(xiàn)[4,7]的研究結(jié)果相同。分析原因，可能是sCD44濃度的升高造成RGC的凋亡及丟失，使得RNFL變薄，從而影響視野；也有可能是sCD44通過促進(jìn)TM凋亡，進(jìn)而增加房水排出阻力，引起POAG的發(fā)生[20]。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在POAG患者房水中sCD44濃度升高，且與視野MD及視盤RNFL厚度呈負(fù)相關(guān)，這為治療和預(yù)防POAG進(jìn)展提供了新的思路。但目前對sCD44如何通過房水作用于TM及RGC，從而引起POAG發(fā)生的作用機(jī)制尚未完全闡釋，今后仍需進(jìn)一步研究。

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