HPV感染相關(guān)問題的再認(rèn)識

陳志遼 林仲秋

作者單位：510120 廣州 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦產(chǎn)科

宮頸癌是婦女最常見的生殖道惡性腫瘤。人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是其主要病因，持續(xù)高危型HPV（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）感染可引發(fā)宮頸病變及宮頸癌。外陰和陰道上皮內(nèi)病變的病因與宮頸上皮內(nèi)病變同源，亦與HPV感染密切相關(guān)。HPV感染的處理主要參考《2015年美國疾病控制和預(yù)防中心對HPV感染的診治規(guī)范》，該規(guī)范不斷更新，主要包括HPV疫苗的推薦、生殖器疣的其他治療方案及宮頸癌篩查［1］。本文就HPV感染、檢測和治療的研究進(jìn)展進(jìn)行回顧。

1 HPV感染導(dǎo)致宮頸癌的致病機(jī)制

德國病毒學(xué)家豪森在1974年發(fā)現(xiàn)了HPV，指出HPV是DNA病毒，并從宮頸癌患者體內(nèi)克隆出HPV 16型和HPV18型，首次提出宮頸癌與HPV感染關(guān)系密切。目前，已發(fā)現(xiàn)100余種HPV亞型，其中30多種與宮頸感染和病變有關(guān)，根據(jù)其致病能力大小分為高危型和低危型兩種。國際癌癥研究協(xié)會的病例對照研究表明，高危型主要有 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 等 15 型，主要可導(dǎo)致高度鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）和宮頸癌的發(fā)生，HR-HPV感染的低度鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）易進(jìn)展為 HSIL；HPV 6 、11、40 、42 、43、44 、54 、61、70 、72、81等 11型歸為低危型，主要可引起生殖道肛周皮膚和陰道下部的外生性濕疣類病變、扁平濕疣類病變和LSIL，多呈一過性，可自然逆轉(zhuǎn)。

HPV通過傷口侵入宮頸鱗狀上皮基底層細(xì)胞，脫去外殼，進(jìn)入細(xì)胞核，將DNA整合到宿主DNA，形成E6、E7片段；基因通過表達(dá)，產(chǎn)生特殊蛋白，抑制p53，導(dǎo)致細(xì)胞異常增生，液基細(xì)胞學(xué)可檢測到意義未明的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cell of undermind significance，ASCUS）、LSIL、HSIL 等細(xì)胞學(xué)改變，陰道鏡活檢則可發(fā)現(xiàn)LSIL到HSIL的病變［2-6］。HPV亞型檢測對宮頸癌早期診斷及治療具有重要意義［7］。劉桂艷等［8］采用第二代雜交捕獲試驗(yàn)（hybridcaptureⅡ，HCⅡ）檢測278例宮頸疾病患者，發(fā)現(xiàn)HPV-DNA在宮頸癌中的陽性表達(dá)率為91.3%（21/23），明顯高于其在慢性宮頸炎中的陽性表達(dá)率30.7%（51/166），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。然而，仍存在 HR-HPV 檢測陰性的宮頸癌，且大約10%的宮頸腺癌發(fā)生與HPV感染無關(guān)，主要包括胃型黏液性腺癌中的微偏腺癌、透明細(xì)胞癌、中腎管腺癌以及漿液性腺癌，這些特殊類型的宮頸腺癌因臨床表現(xiàn)缺乏特異性、常規(guī)篩查手段難以發(fā)現(xiàn)、病理診斷困難等原因，易漏診、誤診，導(dǎo)致錯過最佳治療時機(jī)，預(yù)后不佳［9］。

2 HPV感染相關(guān)的其他疾病

2.1 HPV感染與頭頸部腫瘤

HPV感染在口咽部腫瘤中有與EB病毒相似的發(fā)病機(jī)制。預(yù)防方面要注意食物衛(wèi)生和口腔黏膜損傷，嚼檳榔可引起口腔癌不僅是由于化學(xué)成分，還因?yàn)榭谇粨p傷暴露了口腔鱗狀上皮的基底膜細(xì)胞。有研究顯示頭部和頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）與HPV感染有關(guān)，而感染HIV病毒者更易感染與HPV相關(guān)的疾?。?0］。

2.2 孕前HPV感染的處理

研究報(bào)道有HPV感染的產(chǎn)婦傳染給新生兒的比例約為10%，可能是年輕且未有性生活女性患宮頸癌的危險(xiǎn)因素［11-12］。王曉昌等［13］對西北地區(qū)524例不孕癥女性的宮頸標(biāo)本進(jìn)行HR-HPV檢測，發(fā)現(xiàn)不孕癥女性患者中，HR-HPV感染與支原體和衣原體感染有關(guān)。周潞等［14］研究亦報(bào)道HR-HPV感染可能是女性不孕癥的危險(xiǎn)因素之一，且HPV陽性不孕患者中絕大部分為HR-HPV。因此認(rèn)為，對不孕患者檢測和治療HPV感染，可能是提高妊娠率的方法之一。

3 HPV的檢測

HPV感染引起的宮頸上皮內(nèi)病變并不是單向的病理生理學(xué)發(fā)展過程，會隨各種影響因素改變而出現(xiàn)消退、持續(xù)不變或繼續(xù)發(fā)展。宮頸上皮內(nèi)病變發(fā)展過程的緩慢性為早期診斷提供機(jī)會。HPV檢測有不同方法，各有其特點(diǎn)［15-16］。

3.1 HPV 抗原的檢測

HPV感染人體表皮細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)增殖合成衣殼蛋白而成為HPV抗原成分，免疫酶染色可檢測感染組織細(xì)胞內(nèi)的HPV抗原成分，判斷有無HPV感染。HPV抗原陽性對診斷HPV感染或尖銳濕疣具有重要意義。

3.2 HPV 抗體的檢測

在HPV感染早期，由于感染時間短，HPV尚未誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HPV抗體，血清中可能檢測不到抗HPV抗體。隨著HPV感染時間延長，HPV誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HPV抗體，并可在血清中檢測到，且抗體陽性亦可反映曾感染該病毒。

3.3 HPV-DNA 檢測

HPV檢測還可取病變組織和局部組織黏液、分泌物進(jìn)行HPV-DNA檢測。目前認(rèn)為聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）是檢測 HPV-DNA 及分型較好的方法，是診斷尖銳濕疣及HPV感染最常用的技術(shù)，HPV-DNA檢測主要包括以下方面。

3.3.1 DNA印跡雜交 該法利用堿基互補(bǔ)原理，通過同位素標(biāo)記的核酸探針檢測HPV核酸，并對病毒DNA進(jìn)行分型，早期HPV檢測研究中應(yīng)用較多。缺點(diǎn)為敏感性低、耗時、對樣本要求高。因此，不適用于臨床HPV分型的檢測。

3.3.2 原位雜交技術(shù)（in situ hybridization，ISH） ISH主要用于研究宮頸組織細(xì)胞內(nèi)是否含有HPV的DNA，不需從組織細(xì)胞中提取核酸，能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞研究而不受組織細(xì)胞內(nèi)其他成分影響，并可完整地保持組織和細(xì)胞的形態(tài)。缺點(diǎn)是靈敏度較低、實(shí)驗(yàn)周期長、操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)過程易受多方條件限制、無法同時檢測多份標(biāo)本等。還有一種是利用熒光原位雜交法檢測高度鱗狀上皮病變標(biāo)本中HPV E6、E7 mRNA，其敏感性為 83.3%，特異性為91.3%。

3.3.3 PCR PCR技術(shù)采用DNA聚合酶催化特異性引物選擇性擴(kuò)增HPV的DNA，既可檢出HPV已知序列，亦可檢出未知序列。結(jié)合直接測序法不僅能對HPV-DNA分型，還可發(fā)現(xiàn)HPV少見和變異類型。缺點(diǎn)是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測通常用瓊脂糖凝膠電泳，該法敏感性較差且結(jié)果不易保存。實(shí)時熒光定量PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上將基因擴(kuò)增、分子雜交和光化學(xué)在封閉條件下進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時動態(tài)檢測和結(jié)果自動分析，從根本上解決了擴(kuò)增產(chǎn)物污染和不能定量的問題。此法通過探針雜交進(jìn)一步提高了HPV-DNA檢測的特異性，具有快速、簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床工作和大規(guī)模篩查。缺點(diǎn)是該法主要針對HPV6、11、16和18型感染，易漏診其他HPV亞型。而分析HPV型別時則需應(yīng)用多通道實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，通過采用多種具有不同激發(fā)/發(fā)射波長的熒光物質(zhì)標(biāo)記或通用特異性探針進(jìn)行示蹤檢測HPV的DNA，實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管內(nèi)對不同基因型別進(jìn)行檢測。該法特異性和敏感性均較高，分型的同時還可準(zhǔn)確定量。缺點(diǎn)是分型檢測時工作量大，儀器較昂貴，限制了其廣泛應(yīng)用，目前市場上還未見可分型的熒光PCR產(chǎn)品。

3.3.4 HCⅡ HCⅡ利用化學(xué)發(fā)光對抗體捕獲的信號加以放大，可檢測13種HR-HPV。該技術(shù)采用兩種特異性探針：高危型探針檢測 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、59 和 68 型；低危型探針檢測 HPV 6、11、42、43、44型，方法標(biāo)準(zhǔn)化，檢測效率高。缺點(diǎn)是不能對HPV進(jìn)行分型，當(dāng)任何一種型別的HPV DNA超過閾值，其檢測結(jié)果均為陽性。此外，高危型探針可與其他型別HPV交叉反應(yīng)，例如HPV 53、66、67和73型，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，降低特異性。

3.3.5 低密度基因芯片導(dǎo)流雜交技術(shù)該技術(shù)提高了分子間的相互作用，將傳統(tǒng)雜交法的二維平面作用提升至三維空間的相互作用，提高了DNA分析的特異性，達(dá)到臨床快速檢測的要求。省時、樣本和試劑量較少，降低了檢驗(yàn)成本，提高檢測效率，操作方便，背景干凈，且不發(fā)生常見的交叉污染現(xiàn)象。此外，還可一次性檢測出21種HPV亞型，包括13種HR-HPV（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和 68型）、5種低危型HPV（HPV 6、11、42、43 和44型）和3種中國人群常見 HPV病毒類型（HPV53、66、CP8304型），同時能檢測出混合型感染，最終給出HPV病毒感染分型結(jié)果。HPV檢測的敏感性和特異性均在95%以上，陰性預(yù)測值和陽性預(yù)測值分別為94.80%和 98.27%［17］。

3.3.6 Invader technology技術(shù) 該技術(shù)可檢測出HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14種HR-HPV病毒。優(yōu)點(diǎn)是可不經(jīng)過PCR擴(kuò)增，減少了產(chǎn)生污染的環(huán)節(jié)；缺點(diǎn)是不能進(jìn)行分型。

3.4 HPV RNA 檢查

逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法（Aptima-mRNA）是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的第一個HPV mRNA檢測技術(shù)，是基于E6、E7 mRNA的新一代HPV檢測技術(shù)，可直接檢測出基于HPV的2個致癌基因E6、E7 mRNA，降低傳統(tǒng)HPV DNA檢測對一過性HPV感染的檢出率，可識別出真正有癌變風(fēng)險(xiǎn)的HPV感染。該技術(shù)有兩種檢測試劑盒，分別是Aptima HPV（AHPV）和Aptima HPV 16/18/45 Genotype（AHPV GT），后者可對前者陽性結(jié)果進(jìn)行分型檢測。

總之，不同HPV檢測技術(shù)對同一樣本的檢測結(jié)果可能不同，所有HPV檢測方法均存在一定假陰性率，宮頸癌患者HPV檢測結(jié)果亦可為陰性，其中30歲以下（尤其是25歲以下）年輕婦女一過性HPV感染率高達(dá)91%。因此，HPV檢測以分流細(xì)胞學(xué)異常者為目的，而30歲以上婦女既可采用細(xì)胞學(xué)篩查，也可采用HPV篩查，兩者聯(lián)合篩查效率最高。

4 HPV陽性的處理

HPV陽性的處理方法有隨訪觀察、物理治療、光動力學(xué)和手術(shù)治療。有研究將HPV陽性患者分為單純隨訪組和物理治療組，并定期隨訪薄層液基細(xì)胞學(xué)（thin-cytologic test，TCT）和 HR-HPV。經(jīng) 6、12、24個月隨訪，發(fā)現(xiàn)HR-HPV（－）組無疾病進(jìn)展病例；HRHPV（＋）組疾病進(jìn)展4例，物理治療組疾病進(jìn)展1例。HR-HPV（－）組與 HR-HPV（＋）組的疾病轉(zhuǎn)歸率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；物理治療組疾病進(jìn)展率低于HR-HPV（＋）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且持續(xù)HR-HPV感染導(dǎo)致LSIL進(jìn)展的可能性更高。認(rèn)為持續(xù)性HR-HPV感染是LSIL進(jìn)展的高危因素，應(yīng)合理選擇治療方式，且LSIL治療提倡規(guī)范化、個體化和人性化［18］。

有研究顯示光動力學(xué)治療HPV感染和宮頸內(nèi)瘤樣病變有一定效果，且安全［19］。李華萍［20］選取陰道鏡下活檢為LSIL且經(jīng)HCⅡ法檢測的HR-HPV陽性患者138例，根據(jù)患者病變程度、意愿、年齡及生育要求分成3組，分別采用隨訪觀察、物理治療及宮頸高頻電波刀電圈切除術(shù)（LEEP）處理，6個月及12個月復(fù)查，發(fā)現(xiàn)隨訪組病變緩解率、HPV清除率明顯低于治療組（P＜0.05），但兩組病變加重率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其中物理治療組6個月病變緩解率低于LEEP組（P＜0.05），但12個月病變緩解率差異不大；物理治療組12個月復(fù)查，病變復(fù)發(fā)率明顯高于LEEP組（P＜0.05）。姜華［18］選取婦產(chǎn)科門診經(jīng)病理學(xué)診斷為LSIL的婦女，并按照HR-HPV檢測結(jié)果和患者個人意愿，分為單純隨訪組和物理治療組，定期隨訪TCT和HR-HPV，經(jīng) 6、12、24 個月隨訪，發(fā)現(xiàn) HR-HPV（-）組無疾病進(jìn)展病例；HR-HPV（+）組疾病進(jìn)展4例，物理治療組疾病進(jìn)展 1例；HR-HPV（-）組與 HR-HPV（+）組的疾病轉(zhuǎn)歸率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。因此，在HPV陰性的LSIL隨訪中，應(yīng)重視隱性HPV感染。病毒可能整合在宮頸細(xì)胞DNA內(nèi)，但臨床檢測陰性而誤為HPV陰性，其可能快速發(fā)展為HSIL。

5 HPV的疫苗

5.1 預(yù)防性疫苗

大量實(shí)驗(yàn)室和臨床研究數(shù)據(jù)表明，HPV宿主的免疫反應(yīng)對控制HPV感染和相關(guān)病變有重要作用［21-23］，HPV癌前病變和宮頸癌患者體內(nèi)普遍存在對HPV的低免疫狀態(tài)。HPV預(yù)防性疫苗主要以具有天然空間結(jié)構(gòu)的合成L1蛋白病毒樣顆粒為靶抗原，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的血清中和性抗體，以中和病毒，并協(xié)助腫瘤特異性殺傷T淋巴細(xì)胞清除病毒感染。目前，全球上市的HPV預(yù)防性疫苗有3種，即二價(jià)疫苗Cervarix、四價(jià)疫苗Gardasil和九價(jià)疫苗Gardasil 9。二價(jià)疫苗之所以被稱作二價(jià)疫苗，是因其由兩種類型HPV（16、18型）身上的L1蛋白組成的病毒樣顆粒，這種蛋白不能自我復(fù)制，無法進(jìn)一步感染活細(xì)胞，較安全。四價(jià)疫苗則是擁有HPV16、18、6、11型L1蛋白的顆粒；九價(jià)疫苗則包含 HPV16、18、6、11、31、33、45、52、58 型在內(nèi)的9種L1蛋白顆粒。2017年7月、11月，二價(jià)、四價(jià)HPV疫苗分別在中國大陸上市銷售，而九價(jià)HPV疫苗尚未在中國大陸正式上市。

從臨床效果看，九價(jià)疫苗和四價(jià)疫苗相比，可增加對10%的HPV相關(guān)腫瘤和15%宮頸癌的預(yù)防，與二價(jià)疫苗相比，還可增加90%生殖器疣的預(yù)防［24-25］。理論上九價(jià)疫苗效果更好，預(yù)防范圍更廣泛。但目前能注射九價(jià)疫苗的地區(qū)較少，中國大陸地區(qū)尚未批準(zhǔn)上市。同時，在HPV中，最高危的是HPV16、18型，而二價(jià)疫苗即可對兩者起到很好的預(yù)防作用。接種HPV疫苗后可能有輕度、一過性局部反應(yīng),如紅腫和疼痛。HPV疫苗不宜用于對其他疫苗有嚴(yán)重過敏史者或孕期女性，急性病患者應(yīng)推遲接種。盡管HPV疫苗并不增加接種后暈厥的風(fēng)險(xiǎn)，但疫苗上市后調(diào)查報(bào)告顯示，青春期女性在接種該疫苗后發(fā)生暈厥的概率較高，因此推薦注射疫苗后觀察15 min。

公眾的認(rèn)知與接受度對疫苗的推廣至關(guān)重要，因此要加強(qiáng)相關(guān)健康知識教育，提升公眾對HPV疫苗的接受程度。預(yù)防性HPV疫苗的問世具有里程碑式的意義，是醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大突破，改變了半個多世紀(jì)以來形成的以二級預(yù)防（宮頸癌篩查）為主的宮頸癌預(yù)防模式，使宮頸癌一級預(yù)防（疫苗接種）成為現(xiàn)實(shí)，將促成全新宮頸癌預(yù)防體系的構(gòu)建。

5.2 治療性疫苗

HPV治療性疫苗主要針對已感染HPV的患者，疫苗以模仿HPV病毒外殼起作用，其類型有病毒/細(xì)菌載體疫苗、肽疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗、細(xì)胞疫苗等。治療性HPV疫苗相對于已上市的HPV預(yù)防性疫苗進(jìn)展緩慢，目前重組蛋白疫苗、多肽疫苗已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，且顯示出很好的療效［26］。但治療性疫苗免疫機(jī)制尚不清楚，推測主要是對機(jī)體自身免疫調(diào)控及清除HPV感染細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的瘤細(xì)胞。HPV相關(guān)的腫瘤為腫瘤治療研究提供了很好的模型，相信隨著研究的深入，定能研制出有效的HPV治療性疫苗。預(yù)防性疫苗對已感染HPV患者的治療效果有限，而治療性疫苗則可通過激活細(xì)胞免疫特異性地清除病毒和被病毒感染的細(xì)胞，有望成為治療HPV感染宮頸癌的新手段［27-28］。

綜上，HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件之一，如何治療HPV感染是困擾臨床醫(yī)生的難題，而治療HPV感染是宮頸癌防治的重要環(huán)節(jié)，因此加深對HPV感染相關(guān)問題的認(rèn)識，具有深遠(yuǎn)的臨床意義。