耳聾研究新動向

楊仕明

中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 耳鼻咽喉研究所聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室全軍聲損傷防護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

1 新的耳聾機(jī)制研究

隨著對耳聾機(jī)制研究的深入，科學(xué)家們已從關(guān)注耳蝸內(nèi)各種細(xì)胞的損傷，發(fā)展到更加細(xì)微的耳蝸微環(huán)境的變化。耳蝸微環(huán)境對于維持聽覺上皮功能至關(guān)重要，微環(huán)境的穩(wěn)定主要依賴于以下三個(gè)機(jī)制：K+循環(huán)，Ca2+循環(huán)及谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)共同維持。

在耳蝸內(nèi)K+循環(huán)機(jī)制中起重要作用的可能是血管紋，血管紋中的血迷路屏障功能障礙與噪聲性聽力損失[1]、年齡相關(guān)性聽力損失[2]、自身免疫性疾病[3]、遺傳性聽力障礙[4]和內(nèi)耳的炎性疾密切相關(guān)[5]；Ca2+在耳蝸內(nèi)分布廣泛，具有第二信使作用，參與多項(xiàng)耳蝸生理活動，各種因素均可導(dǎo)致Ca2+超載，引發(fā)一系列細(xì)胞損傷。谷氨酸是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞和I型螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元之間主要的傳入興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)對突觸后膜起營養(yǎng)作用；但過量谷氨酸（如噪聲引發(fā)的免疫反應(yīng)）會導(dǎo)致谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)失衡，導(dǎo)致耳蝸的神經(jīng)毒性，傳入神經(jīng)樹突水腫，嚴(yán)重者可致神經(jīng)元死亡。多種因素，如噪聲、缺氧、遺傳等均可導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境的改變，使得毛細(xì)胞慢慢凋亡或死亡，導(dǎo)致聽力損失。我們課題組發(fā)現(xiàn)的MITF-M基因突變耳聾豬模型，表現(xiàn)為漸進(jìn)性聽力損失，即為血管紋變薄，內(nèi)淋巴電位消失，毛細(xì)胞于出生后漸進(jìn)性凋亡或死亡[6，7]。

在噪聲性聽力損失中，經(jīng)常觀察到血管通透性增加、缺血、白細(xì)胞滲透和內(nèi)皮損傷。PVM/MS(Perivascular Resident Macrophage-like Melanocytes)的激活可能通過減少色素上皮衍生因子的產(chǎn)生而導(dǎo)致血管通透性增加，從而導(dǎo)致緊密連接相關(guān)蛋白的下調(diào)。在年齡相關(guān)性聽力損失病例中，毛細(xì)血管損傷和退化相當(dāng)明顯?；啄ぴ龊瘛Cs(Pericytes)數(shù)量減少和PVM/MS形態(tài)和功能改變可能導(dǎo)致血迷路屏障功能障礙，從而導(dǎo)致聽力喪失。在自身免疫性疾病中，血管紋中的血迷路屏障也是受免疫系統(tǒng)靶向的。例如，自身免疫抗體或循環(huán)免疫復(fù)合物被發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致血迷路屏障破壞和聽力缺陷。血迷路屏障組成成分的基因遺傳缺陷在多種遺傳性聽力障礙疾病中存在，包括Norrie病、Alport病、Nr3b2（-/-）、白色斑點(diǎn)（WS）和Varitint-Waddler-J(Vaj)小鼠突變體和連接蛋白缺陷相關(guān)聽力損失疾病。在炎癥引起的聽力障礙中，發(fā)現(xiàn)血管屏障中的血管紋血管完整性受損。脂多糖（LPS）通過下調(diào)緊密連接蛋白而破壞血管紋中的血迷路屏障，通過經(jīng)血迷路屏障進(jìn)入外淋巴液的血清熒光素的增加表明此現(xiàn)象。血迷路屏障也是氨基糖苷類、鉑類及利尿類等耳毒性藥物的靶點(diǎn)[8,9]。這些藥物均由血管紋上皮細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)而攝取。

2 新的耳聾干預(yù)研究

近年來，針對遺傳性聽力下降治療的研究探索了很多全新的方法，其中最為熱門的方法包括促進(jìn)毛細(xì)胞再生、干細(xì)胞移植以及基因治療。對于哺乳類來說，內(nèi)耳毛細(xì)胞是一次性的，一旦損失便沒有辦法補(bǔ)充，而鳥類和魚類卻可以隨時(shí)產(chǎn)生新的毛細(xì)胞。基于這種差別，促進(jìn)毛細(xì)胞再生的研究一直在進(jìn)行中。目前認(rèn)為，毛細(xì)胞的分化由轉(zhuǎn)錄因子ATOH1調(diào)節(jié)控制。ATOH1位于編碼性別決定區(qū)基因下游Y-box2（Sox2），EYA1和SIX1。可惜的是，截至目前為止，針對成年的哺乳動物ATOH1調(diào)控的研究均未能產(chǎn)生足以恢復(fù)聽力的毛細(xì)胞，且ATOH1的持續(xù)表達(dá)反而會引起大量的毛細(xì)胞凋亡[10]。解放軍耳鼻咽喉研究所對聽覺生理及聾病進(jìn)行了長期的系統(tǒng)研究而且在毛細(xì)胞再生研究方面也已有一定的積累[11-14]。令人振奮的是，最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)圓窗膜以重組腺病毒為載體成功將Math1基因?qū)氡鹦悦@后豚鼠內(nèi)耳[15]，發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后1個(gè)月部分豚鼠聽力開始恢復(fù)，2個(gè)月聽力則有更好的改善[16]。

另外一個(gè)相對熱門的方法是干細(xì)胞移植。將具有分化能力的干細(xì)胞引入聽力受損的耳蝸中，通過適當(dāng)?shù)沫h(huán)境誘導(dǎo)，使其分化成為毛細(xì)胞。干細(xì)胞的來源包括胚胎干細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或從內(nèi)耳提取的干細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞涉及倫理問題，目前用于研究的主要是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。盡管在體內(nèi)和體外均已成功通過誘導(dǎo)使干細(xì)胞分化成為毛細(xì)胞樣細(xì)胞，該研究目前仍存在瓶頸，即在干細(xì)胞移植后，分化出來的毛細(xì)胞并沒有集中分布在Corti器，而是雜亂分布，并且成活率很低[17]。

隨著人類基因組計(jì)劃及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃的實(shí)施，人們對遺傳性聾的認(rèn)識也在分子水平上取到突破。近年來，非綜合征型耳聾逐漸被認(rèn)定為一種單基因病。利用基因編輯的方法，通過對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行基因編輯從而獲得基因缺陷動物，或?qū)σ延械幕蛉毕輨游镞M(jìn)行基因糾正是現(xiàn)階段探索單基因遺傳病最為普遍和有效的研究方案。隨著CRISPR/Case9技術(shù)的應(yīng)用和推廣，短短的幾年時(shí)間內(nèi)，基因編輯技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種遺傳性耳聾的疾病機(jī)理、臨床表現(xiàn)和治療探索的動物模型構(gòu)建中。小鼠是用于研究人類遺傳性耳聾的應(yīng)用最為廣泛的動物模型。針對Vglut3(SlC17A8)的基因治療是目前文獻(xiàn)報(bào)道的第一例成功的哺乳動物毛細(xì)胞基因治療案例[18]。針對常染色體遺傳的 Tmc1[19]，Ush1C[20]，Gjb2[21]均有利用小鼠模型成功的進(jìn)行基因治療的文獻(xiàn)報(bào)道。

3 新的耳聾動物模型研究

動物模型是基礎(chǔ)生物學(xué)和人類疾病機(jī)理研究的基本工具，也是疾病防治研究和治療手段開發(fā)的必經(jīng)之路基石所在。建立合適的耳聾動物模型是研究其發(fā)病機(jī)制和治療手段的一個(gè)十分重要的方法，現(xiàn)已構(gòu)建的耳聾動物模型主要是小鼠、豚鼠和大鼠。盡管采用嚙齒類動物建立耳聾動物模型有很多的優(yōu)點(diǎn)，但是這些模型本身也存在著難以克服的缺陷，使其不能完全滿足醫(yī)學(xué)研究的需要，例如，嚙齒動物在物種親源性、解剖結(jié)構(gòu)、進(jìn)化速率和代謝率等方面都和人類有著較大的差異，并且對于耳蝸內(nèi)部各個(gè)病變部位的取材和觀察都存在著較大的技術(shù)困難。因此我們迫切需要尋找一種新型的、更加優(yōu)良的大動物耳聾模型。

小型豬作為大型哺乳動物模型在耳科學(xué)研究中具有重要地位和廣闊的應(yīng)用前景[22]。首先，小型豬的內(nèi)耳結(jié)構(gòu)和聽覺生理特征與人類相似，大量研究顯示其中耳聽骨鏈、內(nèi)耳耳蝸螺旋器和螺旋神經(jīng)節(jié)等顳骨解剖結(jié)構(gòu)以及聽閾、敏感聽力范圍等較小鼠、豚鼠等和人類顳骨及聽覺系統(tǒng)相似性更高[23-28]，目前已經(jīng)建立完善的小型豬聽覺數(shù)據(jù)庫和小型豬人工耳蝸植入的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)[29]，特別適合耳外科手術(shù)操作基礎(chǔ)訓(xùn)練和聽覺生理相關(guān)研究。其次，小型豬可植入人用電子耳蝸，是一種理想的研究聽覺植入的大動物模型。再次，目前已經(jīng)建立的一系列小型豬耳聾模型，與人類感音神經(jīng)性耳聾具有較高的相似性。我們已經(jīng)通過噪聲暴露方法、乙基亞硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）化學(xué)誘變方法和基因編輯技術(shù)構(gòu)建了小型豬噪聲性聾、Mondini畸形、單側(cè)聾、MITF突變、大前庭水管綜合征等一系列小型豬模型，為研究噪聲性耳聾及遺傳性耳聾發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[30-32]。

近年來，我國耳科學(xué)事業(yè)蓬勃發(fā)展，對新的耳聾機(jī)制的研究，對新的耳聾干預(yù)方法的研究，對新的耳聾動物模型的研究，完美的將基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用相結(jié)合，極大地保障了人民的健康，提高了民眾的生活質(zhì)量。放眼世界，舉目未來，雖然我們?nèi)悦媾R著很多困難，但應(yīng)肯定耳科學(xué)同仁們所取得的成績，戒驕戒躁，繼續(xù)努力。