干細胞胞外囊泡在急性呼吸窘迫綜合征中的治療作用

程婷婷 宋元林

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是在直接和間接原因觸發(fā)下免疫系統(tǒng)與肺泡上皮毛細血管屏障相互作用，急性炎癥反應引起肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，導致肺蛋白通透性增加、彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，進而造成難以糾正的急性低氧血癥[1]。目前主要的治療方式限于肺保護性策略即小潮氣量機械通氣，治療效果欠佳，死亡率仍高達40%～70%[2]。

干細胞具有多向分化潛能和強大的旁分泌能力，近年來在ARDS的臨床前試驗及臨床試驗中展現(xiàn)出樂觀的治療前景，但也存在諸多問題如治療劑量選擇、給藥途徑和時間的確定，以及治療過程中的質(zhì)量控制、細菌學檢測、細胞活性、細胞表型、成瘤性檢測等均有待標準化，并可能增加對膿毒癥、腫瘤、自身免疫性疾病的易感性[3]。研究表明胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)具有類似干細胞的治療作用[4]，為ARDS的治療提供了新的選擇可能。本文就干細胞胞外囊泡在ARDS中治療作用的相關研究進行綜述。

一、胞外囊泡概述

胞外囊泡是由脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，多數(shù)細胞均可分泌產(chǎn)生。根據(jù)大小、形態(tài)、產(chǎn)生來源、分泌機制不同，胞外囊泡可分為3類：

1. 外泌體(exosomes )： 直徑約20～100 nm，是多囊泡核內(nèi)體與母細胞胞膜融合后釋放至胞外形成。表達大量核內(nèi)體標志如四分子交聯(lián)體家族成員、熱休克蛋白、抗淋巴細胞球蛋白-2反應蛋白X、腫瘤敏感性基因101、MHCI類Ⅱ類分子，以及少量磷脂酰絲氨酸，也常含有膜聯(lián)蛋白、網(wǎng)格蛋白。外泌體的釋放與細胞骨架激活有關[5]。

2. 微囊泡(microvesicles , MVs)(也稱核外顆粒體、膜微粒、脫落囊泡等)： 直徑100～1 000 nm，從母細胞胞膜直接出芽脫落形成。含大量磷脂酰絲氨酸、膽固醇、脂筏相關蛋白、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺。MV形成依賴于細胞骨架激活和胞內(nèi)鈣離子濃度。

外泌體和微囊泡均可在生理刺激或細胞損傷時由多種細胞類型釋放，他們包含有多種細胞組分，包含的蛋白和RNA根據(jù)細胞來源及其病理生理狀態(tài)而不同?？赊D(zhuǎn)移生物活性分子(如核內(nèi)體相關蛋白、膜蛋白、脂質(zhì)、mRNA、mircroRNA等)驅(qū)動細胞間信號通訊[6-7]。

3. 凋亡小體(apoptotic bodies, ABs)： 直徑約>1 000 nm，體積接近血小板，由程序性死亡細胞產(chǎn)生，包含有潛在有害或具有免疫原性的細胞組分如DNA片段、非編碼RNA、細胞器等，會被吞噬而清除[8]。

胞外囊泡可從體液或體外培養(yǎng)細胞中按照不同的超速離心、超濾、抗體磁珠免疫沉淀等方法分離獲得[9]。

二、胞外囊泡的生物學功能及機制

EVs可通過多種途徑與受體細胞作用：細胞表面作用、內(nèi)吞小泡內(nèi)化、以及胞膜融合等[10]。EVs攝取效率直接與胞內(nèi)和微環(huán)境的酸度有關[11]。EVs表達多種受體和表面分子，包括組織因子、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)分子、趨化因子受體等，可與靶細胞中的相應配體結合直接作用于靶細胞，如血小板來源的EVs膜富含磷脂酰絲氨酸，為凝血因子的加工提供了表面，在凝血過程中起重要作用[12-13]。EVs可在細胞間傳遞受體和/或生物活性脂質(zhì)，如將粘附分子CD41從血小板傳遞至內(nèi)皮細胞[14]或腫瘤細胞[15]，從而增加這些細胞的黏附性質(zhì)；也可傳遞人免疫缺陷病毒-1的受體CXCR4和CCR5，有助于病毒侵入細胞和病毒播散[12, 16]。EVs可傳遞胞內(nèi)蛋白調(diào)節(jié)靶細胞功能，如內(nèi)皮細胞來源的EVs可傳遞促血管生成分子[17- 18]，內(nèi)毒素刺激的單核細胞Evs可通過傳遞Caspase-1使血管平滑肌細胞死亡[19]。EVs也可參與基因信息的水平傳遞，人內(nèi)皮祖細胞EVs通過將mRNA輸送至內(nèi)皮細胞，激活其血管生成程序[20-22]。并且基因信息交換可是雙向的：干細胞來源的EVs可使組織細胞產(chǎn)生表型變化調(diào)節(jié)細胞再生和分化，損傷細胞釋放的EVs也可將特定信號傳遞給干細胞，觸發(fā)其分化促進修復[7]。骨髓細胞與損傷的肺細胞共培養(yǎng)后，可接受肺細胞EVs，從而表達肺特異性蛋白如表面活性物質(zhì)B和C、以及克拉拉細胞特異蛋白[23]。

根據(jù)細胞來源的不同，EVs可產(chǎn)生免疫刺激或免疫抑制效應。分枝桿菌感染的肺泡巨噬細胞釋放的EVs含有病原驅(qū)動的促炎癥分子，分泌熱休克蛋白70，通過toll樣受體激活核因子kB途徑，引起促炎因子分泌[12, 24]。樹突狀細胞EVs可引起清除抗原的體液反應，產(chǎn)生強烈的抗感染作用[25]。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)衍生的EVs可抑制T細胞激活及干擾素-γ 釋放，刺激抗炎因子IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β 及產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細胞[26]，具有免疫調(diào)節(jié)作用。骨髓MSC及其衍生的EVs在體外也可抑制B細胞增殖。EVs抑制B細胞分化和抗體釋放、以及抑制T細胞增殖活性與骨髓MSC相比其作用較差，T細胞、B細胞與骨髓MSC共孵育較與其EVs共孵育產(chǎn)生的粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和干擾素-γ水平更低，而IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β 水平更高[27]。

干細胞產(chǎn)生的EVs具有促進組織修復作用，損傷細胞和免疫細胞產(chǎn)生的EVs可使干細胞募集、局部定植干細胞可分化，促進組織修復[28]。MSC來源的EVs可促進巨噬細胞向M2類型轉(zhuǎn)化，改善損傷、促進修復[29]。蛋白組學分析表明，受傷組織耗盡了ATP生成的限速酶，不能利用恢復的氧供產(chǎn)生ATP，這種消耗可被MSC產(chǎn)生的外泌體補充，該外泌體富含具有酶活性的糖酵解酶和其他ATP生成酶，如腺苷酸酶和核苷二磷酸激酶等[30]。

三、 干細胞胞外囊泡在ARDS中的作用

干細胞EVs在ARDS中具有類似干細胞的治療潛能，其可通過多種作用機制產(chǎn)生肺保護作用。

干細胞Evs可調(diào)控ARDS炎癥水平。MSC-MVs可減少內(nèi)皮細胞產(chǎn)生IL-6，增加IL-10[31]，抑制巨噬細胞產(chǎn)生HMGB1和TNF-α，下調(diào)iNKT細胞分泌IL-17[32]。在內(nèi)毒素誘導的ARDS小鼠模型中，人骨髓MSC-EVs治療有效改善了炎癥、降低了支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞數(shù)量和巨噬細胞炎癥蛋白-2的水平，并減少了肺泡蛋白滲出，抑制了肺泡水腫形成，而敲除角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)mRNA或血管生成素-1的mRNA均可削弱MSC-EVs的治療作用[33-34]。ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液中或內(nèi)毒素處理過的單核細胞來源的肺泡樣巨噬細胞可產(chǎn)生大量TNF-α和IL-8，但加入含EVs的MSC條件培養(yǎng)基(conditioned medium, CM)后，巨噬細胞向M2表型轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生的TNF-α水平減低。MSC-CM預處理的巨噬細胞可降低支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度、減少炎癥細胞浸潤、減輕肺損傷[35]。

MSC-EVs可增強巨噬細胞吞噬細菌的能力。MSC-CM可顯著增強人單核細胞來源巨噬細胞的吞噬活性，使具有吞噬性的人單核細胞來源巨噬細胞比例增加(28±5)%，吞噬指數(shù)增加9倍[35]。在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的ARDS模型中，MSC-CM可通過線粒體轉(zhuǎn)移增強小鼠肺泡巨噬細胞吞噬比例，在體外人單核細胞來源巨噬細胞感染大腸桿菌時，MSC-CM也可通過線粒體轉(zhuǎn)移顯著增加巨噬細胞攝取大腸桿菌的數(shù)量[36]。而MSC-EVs是否亦可通過其內(nèi)含有的抗菌肽及抗菌蛋白產(chǎn)生抗菌作用尚有待探討[37]。

MSC-MVs可顯著改善LPS誘導的內(nèi)皮細胞通透性，增加內(nèi)皮細胞間連接蛋白VE-鈣粘蛋白和閉合蛋白水平，減少內(nèi)皮細胞凋亡、促進其增殖，該機制依賴于其內(nèi)的肝細胞生長因子[31]。在失血性休克誘導的ARDS中，MSC-EVs可使細胞骨架重排、降低肺血管通透性[38]。在缺氧損傷模型中，MSC-MVs可阻止中性粒細胞穿越內(nèi)皮細胞的遷移[32]。

MSC-EVs可通過線粒體轉(zhuǎn)移改善靶細胞能量代謝狀態(tài)。在內(nèi)毒素損傷小鼠中，骨髓間充質(zhì)干細胞的線粒體通過微囊泡方式釋放后被受損的上皮細胞攝取，可改善肺上皮細胞能量代謝、恢復肺泡上皮細胞ATP濃度、恢復表面活性蛋白分泌、在ARDS中起保護作用[39]。在內(nèi)毒素損傷小鼠中，從MSC到肺泡上皮細胞依賴連接蛋白43的線粒體轉(zhuǎn)移可恢復表面活性蛋白分泌、恢復肺泡上皮細胞ATP濃度、提高生存率[36]。MSC-CM可通過將有功能的線粒體轉(zhuǎn)移至肺泡巨噬細胞中，使其氧化磷酸化增強，進而調(diào)節(jié)其表型轉(zhuǎn)換，但此作用可被ATP合酶抑制劑所阻斷[35]。

MSC-EVs可抑制ARDS中TGFΒ1誘導的纖維母細胞向肌纖維母細胞分化，抑制纖維化形成[40]。在博萊霉素誘導的肺損傷中，Ⅱ型肺泡上皮細胞系衍生的外泌體miR-371b-5p可促進Ⅱ型肺泡上皮細胞存活和增殖，促進損傷肺泡的上皮細胞再生[41]。

MSC-EVs可抑制禽、豬流感、人流感病毒感染所致的ARDS中紅細胞凝集反應，可抑制流感病毒復制和病毒誘導的肺上皮細胞凋亡。在豬的流感病毒模型中，氣道內(nèi)注入MSC-EVs可顯著減少鼻拭子脫落的病毒、肺部的流感病毒復制和肺內(nèi)促炎癥細胞因子的產(chǎn)生。組織病理學結果顯示，MSC-EVs可減輕豬流感病毒引起的肺損傷[42]。

此外，干細胞外泌體可作為天然的基因傳遞載體。文獻報道體細胞重組的人誘導多能干細胞純化的外泌體可將siRNA傳遞至人肺微血管內(nèi)皮細胞[43]，抑制細胞間粘附分子-1蛋白表達及由LPS誘導的多形核細胞-內(nèi)皮細胞的粘附[44]。

四、干細胞胞外囊泡應用的問題

與干細胞相比，EVs具有許多優(yōu)勢，如歸巢能力好可避免在其他器官中不需要的累積，沒有免疫原性可避免免疫排斥，非自我復制、產(chǎn)生腫瘤可能性小，避免細胞靜脈注射引起肺栓塞可能[45]。已有干細胞EVs在1型糖尿病疾病(NCT02138331) 、急性缺血性腦卒中(NCT03384433)中的Ⅰ期臨床研究[4]。越來越多的證據(jù)表明干細胞EVs(包括外泌體、MVs或干細胞CM)有望作為無細胞治療應用于ARDS患者。但EVs的作用機制仍待進一步研究，如哪些信號調(diào)節(jié)了生物活性分子的轉(zhuǎn)移、哪些表面受體可能產(chǎn)生選擇特異性、哪些刺激可觸發(fā)EVs釋放等尚不明確，了解這些機制有助于EVs作為診斷標志、作為藥物和基因載體、以及作為新的治療手段[46]。應用于臨床前尚有許多問題有待解決：如臨床應用需要大規(guī)模擴增，如何通過不同的預處理改變EVs成分和表型，從干細胞中分離純化EVs的方法有待優(yōu)化，EVs內(nèi)的RNA、mircoRNA、脂質(zhì)、蛋白成分鑒定復雜，干細胞EVs在呼吸系統(tǒng)疾病中的生物分布、EVs治療的長期效果等均需進一步研究[4, 45- 46]。干細胞胞外囊泡應用于ARDS的臨床治療尚任重而道遠。