肺移植免疫相關的研究進展及展望

洪文娟 洪志鵬

終末期肺病患者缺乏有效的內科治療手段，其導致的肺功能衰竭致殘率和致死率高，因此肺移植已成為治療終末期肺病的有效方法。肺移植是指采用自體肺葉、同種異體肺葉、單側肺、雙側肺、心肺聯(lián)合，甚至不同物種的異種肺置換病肺，重建肺生理功能的技術，是胸外科不可或缺的重要工作之一。1983年首例人的肺移植獲得成功，目前臨床肺移植多以同種異體移植為主，自體肺移植應用于根治肺癌，異種肺移植尚未從實驗室走進臨床。據國際心肺移植協(xié)會(The International Society for Heart and Lung Transplantation Transplant Registry，ISHLT)資料統(tǒng)計，截至2016年6月30日，全球成人肺移植累計60 107例，心肺移植3 992例，年成人肺移植手術量2015年為4 122例[1]。雖然肺移植在該領域取得了長足的發(fā)展，手術適應癥不斷拓展，在外科技術操作水平層面展現出幾乎沒有無法逾越的難關，但是較為突出的問題依然是移植免疫排斥反應導致的移植肺功能喪失，極大的影響了肺移植患者的生活質量和生存期。我國肺移植起步于1979年，作為一門新興的學科走過了近40年的路程[2]。迄今全國肺移植總量939例，移植經驗和技術得到高度認可。盡管基礎研究成績斐然，但學術前沿與國際先進水平尚存差距。2016 年我國腦死亡和心臟死亡器官捐獻者達4 080余例，而肺移植為204例，僅利用了不到5%的供肺[3]。因此供肺的利用面臨著巨大的挑戰(zhàn)，但同時也是機遇，研究者應充分利用供肺資源，掌握肺移植的研究現狀，把握好研究思路和研究方法，使肺移植的基礎及臨床研究取得創(chuàng)新性的飛躍。

一、肺移植免疫的作用機理和特點

肺移植免疫是受體免疫系統(tǒng)與供體肺抗原的特異性免疫應答。供體肺抗原除組織相容性抗原(MHC, mH, ABO)外，與其它移植器官相比肺是進行氣體交換的器官，同時外界環(huán)境的微生物從鼻孔吸入到肺泡，構建了一個自己的微生物群(microbiota)，作為呼吸道守護者，參與維持呼吸生理和免疫的內環(huán)境穩(wěn)定。肺移植供體和受體呼吸道內的兩個微生物王國可能通過調整天然免疫的級聯(lián)反應，改變抗原遞呈細胞(antibody presentation cells, APCs)的能力，致敏T細胞，影響移植排斥[4-5]。臨床上可見嚴重的排斥反應通常緊隨細菌或病毒感染之后。

供體移植肺抗原與受體間的差異是導致排斥反應的物質基礎，通過直接通路、部分或不完全直接通路(semi-direct pathway)和間接通路激活T細胞。直接通路指受體T細胞直接識別供體APCs表面的MHC抗原，活化CD8 T細胞和CD4 T細胞。間接通路則是受體MHC Ⅱ類分子將供體MHC多態(tài)區(qū)域的多肽即脫落的抗原提呈給T細胞，活化CD4 T細胞，以及激活天然免疫系統(tǒng)，導致移植肺功能紊亂。通過間接識別非主要組織相容性復合物分子(non-major histocompatibility complex molecules, non-MHC)基因編碼的異己抗原決定簇，激活受體單核吞噬細胞與分化，增強異體反應T細胞的致敏。不完全直接通路是供體完整的MHC分子轉移給受體的APCs，產生免疫應答，間接識別的CD4 T細胞交叉調控直接識別的CD8+T或CD8-T細胞的功能[6-8]。

移植肺所攜帶的異體MHC抗原細胞如過路白細胞(主要是APCs)、淋巴細胞和碎片組織進入受體，激活CD8T和CD4T細胞，CD8T細胞直接攻擊移植肺的靶細胞，CD4T釋放IL2等細胞因子；B細胞在輔助細胞2(type2 T helper, Th2)細胞釋放IL3、IL4、IL5的幫助下，轉化為漿細胞并產生供體特異性抗體(donor specific antibodies, DSA)，激活補體，引起補體C4裂解為小分子片段的C4a和大分子片段的C4b，再轉換為補體經典活化途徑裂解成份C4d，與毛細血管基底膜、內皮細胞Ⅳ型膠原結合，DSA作用于移植物內皮細胞表面的抗原，產生微血管炎、內皮損傷和一系列分子改變，導致包括超急排斥、急性排斥和慢性排斥反應損傷均在內的抗體介導排斥反應(antibody-mediated rejection, AMR)，導致移植肺失敗。AMR是以移植肺功能障礙、組織病理學改變和DSA為特征的臨床綜合征，其診斷依據有賴于組織病理學改變，治療通常以綜合管理為主，包括靜脈內免疫球蛋白(intravenous immune globulin，IVIG)、血漿置換、單抗和C1酯酶抑制劑等處理[9-12]。

二、外泌體、DMAPs、mi RNA 和長鏈非編碼RNA

外泌體(exosomes)直徑均30～100 nm，從許多細胞釋放，在生理、病理和移植免疫系統(tǒng)都發(fā)揮著重要的作用。經過外泌體轉導的細胞與細胞間遠程通訊，將完整的供體MHC分子信息從供體樹突狀細胞傳遞至受體樹突狀細胞表面，參與肺移植急性排斥反應和慢性排斥如閉塞性細支氣管炎(bronchiolitis obliterans syndrome, BOS) 的免疫發(fā)病過程[13]。

移植免疫應答不但能夠識別異體抗原，還能夠識別“危險信號”(danger/damage associated molecular patterns, DMAPs)，DMAPs源于機體自身的內源性分子。它們是細胞外熱休克蛋白(extracellular heat shock protein, eHsp72)、尿酸晶體(uric acid crystals)、線粒體DNA、高遷移率族蛋白(high mobility group box1, HMGB1)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)，可激活天然免疫和機體的無菌性炎癥反應[14]。

mi RNA 是小的內源性非編碼RNA分子，長約22個核苷酸，轉錄后調控基因表達和免疫過程，調節(jié)免疫細胞的增殖與分化(miR-185-5p, miR-200a-3p)，抑制NF-κB的表達(miR-26a-5p, miR-140-3p, miR-339-5p)[15]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNA)是非蛋白編碼轉錄長度大于200的核苷酸。lncRNA在移植免疫中的作用與激活免疫相關，研究表明發(fā)生免疫移植排斥反應時，lncRNA表達升高，有效的抗排斥治療后恢復正常。小鼠心臟移植后lncRNA表達上調，說明lncRNA可以用于早期診斷或預測急性排斥反應[16]。

三、移植肺的保護和保存、缺血再灌注損傷激發(fā)的炎癥事件與免疫損傷

供肺保存不良可導致排斥反應，支氣管上皮和肺毛細血管內皮MHC表達增加，以及細胞間粘附分子ICAM的升高[17]。我們課題組長期聚焦于供體移植肺的保護研究，在離體肺損傷的保護及其機制方面取得了系列原創(chuàng)性成果，通過動物實驗提出了更加符合生理的保存方法，更好的保護了離體肺的器官活性、組織結構及正常功能，降低了免疫損傷，有望為肺移植患者提供優(yōu)質肺源。

缺血再灌注損傷對移植免疫排斥的發(fā)生與發(fā)展具有重要的影響，天然免疫細胞表面的Toll樣受體能夠識別缺血再灌注損傷產生的DMAPs，產生天然免疫反應以及T細胞活化所需的信號(粘附分子、細胞因子等)，增強T細胞介導的排斥反應。減輕缺血再灌注損傷的天然免疫損傷，則有助于調控抗原特異性排斥反應[18]。

四、表觀遺傳與移植免疫

表觀遺傳是DNA序列以外的化學標記編輯的遺傳密碼，通過DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑、遺傳印記、隨機染色體失活和非編碼RNA從多個層面調控基因表達，可實現對移植免疫的精準調控[19]。以miRNA作為移植免疫耐受的生物標記物，通過miRNA芯片能夠發(fā)現具有調控移植排斥反應的miRNA。

五、免疫抑制和免疫耐受誘導

肺移植的適應證不斷向兒童、高齡、HIV和HCV感染性疾病患者或以前不能移植的危重癥病人擴大。肺移植排斥反應的大小取決于宿主識別異體抗原T細胞的數量、攻擊頻率、細胞分化階段和先天免疫的激活程度。 肺移植急性排斥反應典型臨床表現為呼吸困難、低熱、肺門周圍間質性浸潤、缺氧和白細胞升高。急性排斥反應的次數和嚴重程度和慢性排斥反應的發(fā)生明顯相關，慢性排斥的病理特征為BOS，但是并非所有的移植后BOS都是免疫介導，誤吸或慢性感染亦可導致。慢性移植肺功能不全(chronic lung allograft dysfunction, CLAD)是目前遠期生存的一大障礙，其危險因素有感染(巨細胞病毒、曲霉菌、假單胞菌)、胃食管返流、AMR等。免疫抑制藥物是肺移植取得成功的關鍵，所有臨床移植均依賴于免疫抑制藥物治療移植排斥。

聯(lián)合用藥顯著增強了抗移植排斥的效果：①鈣調磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor, CNI)他克莫司(tacrolimus)、環(huán)孢素；②抗增殖劑嗎替麥考酚酯、硫唑嘌呤 ③糖皮質激素。

針對AMR的臨床用藥有單克隆抗體(利妥昔單抗、依庫麗單抗、貝利木單抗、托珠單抗)、普羅沙福、硼替佐米、卡非佐米和IVIG、血漿置換；針對CLAD的有阿奇霉素、環(huán)孢素霧化吸入、孟魯司特；抗纖維化的尼達尼布、吡非尼酮和甲氨蝶呤；治療頑固性排斥反應的有抗胸腺細胞球蛋白、阿侖單抗、體外光分離置換(extracorporeal photopheresis, ECP)和全身淋巴組織照射(total lymphoid irradiation, TLI)。他克莫司長效釋放劑、舌下含服劑和靜脈給藥的新型制劑，可維持免疫治療。通過藥代動力學的監(jiān)控，達到免疫抑制劑用藥最小化，療效最大化，并最大限度降低毒副作用(腎毒性、神經毒性、高氨血癥和惡性腫瘤)，提高無病生存期(CLAD-free survival)。免疫治療在保護移植肺的同時還需要避免長期用藥的毒性作用。

如何才能不以犧牲全身免疫防御能力為代價，接受外來的器官，使移植肺被作為受體自身器官的一部分，不會被排異，建立免疫耐受，或許是解決該問題的選項之一：①功能性免疫耐受，不用免疫抑制藥，受體免疫系統(tǒng)不排斥供體器官；②部分免疫耐受，低劑量免疫抑制藥即可維持治療，防止急、慢性排斥；③自發(fā)性免疫耐受，移植手術后未經任何特殊的誘導手段，而自發(fā)形成的免疫耐受。免疫耐受是異體器官與宿主共存無免疫損傷的一種狀態(tài)，形成機制與嵌合體(微嵌合、全嵌合、混合嵌合)等有關。通過阻斷特異性移植免疫應答、主動免疫、誘導免疫偏離、干細胞、胸腺移植和復合組織移植建立嵌合體(chimerism)等手段產生移植耐受，(如應用IL-2受體拮抗藥巴利昔單抗(basiliximab)或胸腺細胞球蛋白)，使肺移植患者生存獲益[20-23]。

研究并闡明肺移植的免疫應答和免疫耐受機制，降低肺移植后的排異反應，尤其是慢性排異的發(fā)生，延長移植肺的使用壽命，仍有許多基礎研究尚待深入。

六、肺的再移植

肺的再移植手術適應證可概括為氣道并發(fā)癥、原發(fā)性移植物功能障礙(primary graft dysfunction, PGD)導致急性移植肺衰竭、難治性排斥反應和CLAD。有的病人再移植術后獲得了很好的生存結果，近期文獻報道30 d、90 d、1年、3年和5年生存率再移植組分別為96.5%、96.5%、88.9%、74.5%和63.8%；首次移植組為99.2%、98.2%、89.3%、68.1%和53.1%，可見再移植5年生存率高出首次移植10.7個百分點。通常65%的患者再移植術后5年內發(fā)生慢性排斥，28.5%的患者1年內發(fā)生過1次急性排斥反應。對已經發(fā)生初次移植排斥的受體進行第二方供體肺的再移植，依然遵循初次移植排斥的基本規(guī)律。初次與再次移植的排斥反應交叉，DSA負荷增大，再移植的免疫狀態(tài)可能更為復雜[24-25]。

七、異種移植

異種移植的免疫障礙包括： ①受體內天然抗體介導的超級排斥反應；②急性體液異種移植排斥反應和細胞介導的排斥反應；③血栓微血管病和慢性排斥反應?；蚬こ虖脑搭^上很大程度的克服了超急排斥反應和保護移植器官功能。2003年第一個α-1，3-半乳糖基轉移酶基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase gene-knockout, GTKO)的基因修飾豬產出后，將基因修飾豬的心臟移植給狒狒，存活了945 d，腎移植存活了136 d，肺移植卻只存活了1 d多。除了形態(tài)學改變外，與肺內豐富的巨噬細胞聚集相關，并涉及區(qū)域免疫即組織滯留免疫細胞(tissue-resident lymphocytes)機制。單基因修飾只能消除單一因素的影響如人類補體或血栓調節(jié)蛋白基因、CD39、人類組織因子途徑抑制劑基因等的轉入。人工核酸內切酶介導的基因編輯技術的發(fā)展，例如：鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFNs)技術、轉錄激活因子樣效應物核酸酶技術(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR )技術，現今已能構建多基因修飾，隨著基因編輯技術的進步，將有力的促進異種移植從實驗室向臨床轉化，但能否實現異種肺移植，臨床應用還面臨著巨大的挑戰(zhàn)[26-27]。

八、組織工程肺

肺移植現今與基礎醫(yī)學有著廣泛的學科聯(lián)系，通過多學科交叉和肺移植團隊建設，使知識結構向基礎醫(yī)學縱向延伸，將把新的研究成果及時整合，積極參與到國際競爭與協(xié)作中，并利用轉化醫(yī)學(translational medicine)將基礎研究和臨床緊密連接。

現實生活中，利用移植肺中質檢不合格的肺源，制造脫細胞支架成為了現實。脫細胞支架由細胞外基質構成，宏觀和微觀更接近解剖結構。通過復合因子誘導，可調節(jié)細胞的生長、繁殖、分化。理想的細胞外基質應具備良好的生物相容性，在體內不引起炎癥反應和毒性反應；能被自身組織所取代；在體內可保持特定形狀；表面化學特性和表面微結構利于細胞的粘附和生長；降解速率可根據不同細胞的再生速率而進行調整。脫細胞后支架的質量評估：可通過分析基質超微結構、毛細血管基底膜和肺泡小葉間隔是否保留完整，其中上皮細胞和血管內皮細胞是否容易黏附和分化將是脫細胞是否成功的重要指標。 肺組織工程為解決移植免疫排斥帶來了新希望，目前仍有許多研究障障，需要更多的努力和探索[28]。

九、免疫功能調控

肺移植的免疫調控貫穿于免疫應答的全過程，移植免疫可以通過多層面、多種機制包括表觀遺傳調控機體的免疫細胞功能，移植損傷可能改變染色質的結構和功能，影響基因的轉錄與表達，通過mRNA修飾如RNAm6A的修飾從而實現基因轉錄后調控。m6A修飾經IL-7/STAT5/SCOS信號通路控制T細胞免疫穩(wěn)態(tài)。蛋白質翻譯后修飾(post-translational modification, PTM)參與了關鍵免疫信號通路的調控，實現對免疫細胞發(fā)生、分化、活化、功能和終止，以及體液免疫的精準調控。通過能量代謝途徑亦可影響免疫系統(tǒng)對DMAPs的感知和應答[29]。

十、結語

隨著肺移植手術適應證的不斷拓展，呼吸道微生態(tài)免疫、AMR、外泌體、DMAPs、miRNA和lncRNA，以及免疫細胞功能的表觀調控、PTM調控和細胞代謝調控，為我們深入研究肺移植免疫機制的全貌提供了契機。移植排斥反應涉及多種免疫細胞，T細胞和B細胞是機體的二大衛(wèi)士，在移植排斥過程中發(fā)揮著重要作用。在移植的實體器官中，肺的獲取、保護和保存有其特殊性。臨床免疫抑制劑以聯(lián)合應用、局部給藥和誘導免疫耐受為主要措施。再移植是治療肺移植術后移植肺衰竭的重要手段。異種移植的免疫學障礙通過基因工程、嵌合體誘導耐受等技術逐漸得到克服。組織工程肺為擴大供肺來源提供了新的途徑。