自噬與腦卒中的研究進展

葉櫻澤 熊曉星(綜述) 古麗娟(審校)

自噬是指真核細胞內(nèi)的自噬體將胞內(nèi)變形、衰老或損傷的細胞器和生物大分子包裹轉(zhuǎn)運至溶酶體腔中消化降解的過程，是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細胞周期的一條重要代謝途徑。自噬的正常完成是真核細胞維持自穩(wěn)狀態(tài)的基礎(chǔ)，自噬的缺陷或過度激活會導(dǎo)致機體許多疾病的發(fā)生。最新研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中自噬的過度激活可促進神經(jīng)元損傷。腦卒中是由于腦血管阻塞(缺血性腦卒中)或破裂(出血性腦卒中)引起的腦局部血液循環(huán)障礙和腦組織結(jié)構(gòu)功能紊亂的一類疾病，其可導(dǎo)致嚴重的認知、運動、感覺等功能異常，甚至出現(xiàn)較高的致殘率和致死率。相關(guān)研究報道，在發(fā)生腦卒中的病理條件下自噬過度激活、不足或缺陷均可促進細胞死亡[1-2]。

自噬是真核細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機制，它能否正常完成是機體內(nèi)多種生理和病理過程的基礎(chǔ)，同時它與許多疾病的發(fā)病及預(yù)后密切相關(guān)。缺血性腦卒中作為一種導(dǎo)致人類較高致殘率和病死率的疾病，其發(fā)病機制尚不完全明確，而自噬在腦卒中中可能會過度激活或抑制，與腦缺血后細胞死亡信號通路的激活以及炎性反應(yīng)等有關(guān)。本研究就自噬在缺血性腦卒中中的作用進展作一綜述。

1 自 噬

1.1 自噬的概念、成分及形成過程

自噬是指維持真核細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一條重要途徑。在正常生理條件下自噬保持在基本水平，對機體有保護作用，但在多種應(yīng)激條件下如饑餓、缺氧、線粒體損傷、炎癥反應(yīng)和病原體感染等[3]均可誘導(dǎo)自噬過度激活，從而損傷組織細胞。在自噬的整個過程都由自噬基因(autophagy-related gene，Atg)編碼的自噬相關(guān)蛋白調(diào)控。迄今為止，已有Atg1-34共34個自噬基因被成功克隆，任何一種Atg的缺失或突變都會導(dǎo)致自噬異常或者無法發(fā)生[4]。

細胞自噬的經(jīng)典形成過程包括起始、前自噬體(pre-autophagosomal structures,PAS)形成、延伸閉合、成熟、自噬溶酶體形成和降解等幾個步驟[5]。細胞受到外界應(yīng)激條件的刺激后自噬在起始信號的調(diào)控下被激活，細胞質(zhì)內(nèi)形成1個雙層膜杯狀結(jié)構(gòu)的PAS；在自噬相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)下PAS不斷延伸包裹形成的球狀自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，并在溶酶體內(nèi)的水解酶作用下將其包裹的內(nèi)容物消化降解成氨基酸或多肽等物質(zhì)重復(fù)利用維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。此外,自噬溶酶體將底物降解完成后從頂端伸出1個管狀結(jié)構(gòu)，斷裂后形成原溶酶體,接受新的溶酶體水解酶,逐漸形成成熟的溶酶體,完成溶酶體再生。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬對受損的細胞器或蛋白質(zhì)進行識別并可選擇性地包裹和清除[6-7]。

1.2 自噬的信號調(diào)控

自噬的精準調(diào)控對細胞應(yīng)對外界環(huán)境的刺激至關(guān)重要，多種信號分子在自噬的形成過程中發(fā)揮調(diào)控作用，主要包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、Beclin-1、AMP依賴的蛋白激酶(adenosine5,-monophosphate-actived protein kinase，AMPK)、p53、Rab7等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.2.1 mTOR途徑調(diào)控的自噬

mTOR是一種在進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通常以兩種復(fù)合體的形式存在：mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)。前者主要參與調(diào)節(jié)細胞生長、細胞周期進程和細胞程序性凋亡等，而后者在細胞骨架蛋白的構(gòu)建和細胞存活中發(fā)揮重要作用。mTOR還可感受細胞內(nèi)多種信號分子的變化，是自噬啟動階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，常通過抑制Atg1/ULK1蛋白酶復(fù)合物的磷酸化狀態(tài)，從而抑制自噬的發(fā)生[8]。

1.2.2 Beclin1途徑調(diào)控自噬

Beclin1蛋白作為另1個自噬相關(guān)蛋白，主要在起始階段發(fā)揮重要作用，在自噬啟動時它與VPS34、Atg14蛋白形成三聚體后不斷地招募自噬相關(guān)蛋白推動自噬的進行。Beclin1與下游自噬相關(guān)因子結(jié)合形成復(fù)合物后可正向或負向調(diào)控自噬水平，但具體的功能機制尚未完全清楚。通常認為Beclin1與Bcl-2、VPS34等因子結(jié)合形成的復(fù)合物最常見[9]。Bcl-2是一種常見的凋亡抑制因子，與Beclin1結(jié)合形成復(fù)合物，促使Beclin1從p150/VPS34復(fù)合體中解離出來，抑制Beclin1依賴的自噬通路，負向調(diào)控自噬水平。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，死亡相關(guān)蛋白激酶能通過與Bcl-2競爭結(jié)合位點，促進細胞自噬，而VPS34作為細胞自噬的激活因子，與Beclin1結(jié)合后形成的復(fù)合物可正向調(diào)控Beclin1信號通道，上調(diào)細胞自噬水平[11]。

1.2.3 其他相關(guān)途徑調(diào)控的自噬

AMPK作為調(diào)節(jié)細胞代謝的一種蛋白激酶，在缺血缺氧等應(yīng)激條件下被激活后可參與自噬的發(fā)生，主要通過AMPK-磷酸化結(jié)節(jié)硬化癥復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex,TSC2)/mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白- mTORC1等兩條通路使mTOR活性被抑制，從而誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生[12]。

作為“分子警察”的p53，雖是目前人類發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的抑癌基因，但近年研究發(fā)現(xiàn)p53對自噬具有調(diào)節(jié)作用，Gauster等[13]研究發(fā)現(xiàn)通過藥物抑制p53活性能使機體細胞自噬水平升高。

Rab7是GTP酶超家族的成員之一，主要在自噬形成的后期即自噬體的成熟階段起決定性作用，Zhan等[14]研究發(fā)現(xiàn)同型融合及液泡蛋白分選復(fù)合物與Rab7-GTPase可相互調(diào)控，并在自噬體與溶酶體膜融合期間調(diào)節(jié)Rab7的活性狀態(tài)，從而影響自噬體的成熟和溶酶體的形成，維持溶酶體的功能，催化自噬泡與溶酶體融合。

2 缺血性腦卒中與自噬

缺血性腦卒中是由于局部供血中斷造成該血管供應(yīng)區(qū)的腦組織缺血缺氧所致的一類疾病，可導(dǎo)致一系列嚴重的病理生理變化，不僅包括神經(jīng)元不可逆損傷，還可引發(fā)神經(jīng)元自我修復(fù)。除了細胞凋亡、壞死這兩種主要的方式，自噬也參與其中，但其具體機制尚未完全清楚。

2.1 自噬在缺血性腦卒中的激活和調(diào)控機制

2.1.1 自噬在缺血性腦卒中的激活

神經(jīng)元作為體內(nèi)一種特殊的細胞類型，對糖原的儲存極少，所以正常情況下它的自噬水平較低，自噬體的生物合成也較少，但在發(fā)生缺血性腦卒中或腦缺血再灌注損傷時中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自噬就可能被激活。1995年Nitatori等[15]首次在沙土鼠短暫性腦缺血模型內(nèi)用電子顯微鏡觀察到海馬CA1區(qū)細胞的自噬體，發(fā)現(xiàn)自噬被活化后不斷有學者對自噬在腦缺血中的激活與調(diào)控機制進行進一步研究。2009年P(guān)uyal等[16]在小鼠短暫性局灶性腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的溶酶體和自噬泡活性增強。2015年Youle等[17]在研究腦缺血后自噬水平的變化時發(fā)現(xiàn)缺血能激活自噬。

2.1.2 自噬在缺血性腦卒中的調(diào)控機制及相關(guān)信號通路

當發(fā)生腦部血管局部中斷后周圍的細胞缺血缺氧，自噬被激活，但調(diào)節(jié)腦缺血中自噬活化的信號通路非常復(fù)雜，主要包括Ⅲ型PI3K-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,Akt)-mTOR、AMPK-mTOR、Beclin1-Bcl-2復(fù)合物、活性氧(reactive oxygen species，ROS)-線粒體自噬、UVRAG-VPS16-Rab7，缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)等信號通路。

在發(fā)生缺血性腦卒中時腦部血管局部中斷，神經(jīng)元的糖代謝途徑供能減少，糖異生增多導(dǎo)致氨基酸減少，最終出現(xiàn)生長因子生成減少，后者可通過Ⅲ型PI3K-Akt-mTOR途徑誘導(dǎo)細胞自噬[18]。III型PI3K-Akt在靜息狀態(tài)下普遍存在于細胞質(zhì)內(nèi)，但細胞受到生長因子的刺激后就被激活聚集到細胞膜上，激活下游Akt磷酸化，后者可磷酸化TSC2，減弱對小G蛋白Rheb(Ras homolog enriched in brain)的抑制作用。小G蛋白Rheb活化后可激活mTORC1信號通道，負向調(diào)控自噬的激活。所以，在腦缺血時PI-3KIII-Akt-mTOR途徑的激活對自噬起到負向調(diào)控作用[19]。

Bcl-2蛋白家族作為凋亡抑制因子，是缺血性腦卒中后神經(jīng)元凋亡的重要調(diào)控器，包括破壞線粒體膜電位和促進細胞色素C釋放的促凋亡蛋白(Bax、Bcl-XS、Bak、Bid和Bad)及與之功能相反的抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-XL)。在發(fā)生腦缺血時細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，Bcl-2通過結(jié)合Beclin-1形成復(fù)合物，抑制Beclin1依賴的自噬通路，減少自噬的發(fā)生，從而減少缺血缺氧導(dǎo)致的細胞死亡及腦組織損傷[19-20]。

在細胞發(fā)生缺血缺氧時HIF-1被激活后參與自噬的形成[21]。HIF-1由誘導(dǎo)型ɑ亞基和組成型β亞基兩部分組成。缺氧時細胞內(nèi)的泛素化被抑制，誘導(dǎo)ɑ亞基堆積和β亞基發(fā)生二聚化，形成更多的HIF-1，HIF-1可以激活和轉(zhuǎn)錄細胞內(nèi)多種缺氧反應(yīng)基因，如促紅細胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、α-腺病毒E1B及Bcl-2相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus e1binteracting protein 3，BNIP3)等。其中BNIP3可以通過與beclin-1競爭結(jié)合Bcl-2而誘導(dǎo)自噬發(fā)生[22]。同時，HIF-1的激活也可以促進線粒體BNIP/BNIP3L的表達增多，后者與Beclin1競爭結(jié)合Bcl-2/Bcl-XL，導(dǎo)致游離的Beclin1增多，后者與多種蛋白結(jié)合形成磷脂酰肌醇3激酶復(fù)合體，調(diào)節(jié)自噬蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，誘導(dǎo)自噬[23]。

在細胞發(fā)生嚴重的缺血缺氧時線粒體的功能或結(jié)構(gòu)可能受到損傷，能量供應(yīng)減少而促進AMPK磷酸化，通過AMPK-mTORC1通路來促進自噬的發(fā)生[24]。神經(jīng)細胞線粒體功能損傷后胞內(nèi)ROS急劇增多[25]，可通過兩條途徑調(diào)控自噬：(1)氧化半胱氨酸殘基的催化位點激活A(yù)TG4的蛋白水解活性，調(diào)控自噬的形成；(2)使線粒體氧化損傷，發(fā)生功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，誘導(dǎo)發(fā)生線粒體自噬。同時線粒體結(jié)構(gòu)損傷后胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度升高，導(dǎo)致AMP/ATP比值增加，進而激活A(yù)MPK-TSC2-mTORC1的途徑來進一步調(diào)控細胞自噬水平。

2.2 自噬在缺血性腦卒中的雙重作用

盡管有明確的研究證明自噬在缺血缺氧后被激活，但其病理變化過程仍然存在著很多爭議。大量的研究證實，自噬通過促進損傷蛋白質(zhì)和細胞器的清除而在缺血性腦卒中中發(fā)揮神經(jīng)保護作用，從而有利于能量的循環(huán)利用和細胞防御。但是，這些研究結(jié)果卻難以解釋腦細胞死亡的上升指數(shù)與自噬活動的增強成正比的現(xiàn)象，這就引發(fā)了在腦卒中時自噬的激活是否最終導(dǎo)致病理改善或惡化等問題。

諸多研究發(fā)現(xiàn)，自噬在缺血引起的神經(jīng)元死亡中具有保護作用，但機制仍不清楚，其可能通過降解壞死或損傷的神經(jīng)突觸為神經(jīng)元提供能量，也可能通過降解細胞中的耗能產(chǎn)物以維持細胞內(nèi)離子平衡，從而延遲神經(jīng)元死亡。Chauhan等[26]亦觀察到腹腔注射雷帕霉素后減小大鼠局灶性腦缺血后的梗死體積，提示自噬對缺血性腦卒中具有保護作用。

然而，也有研究發(fā)現(xiàn)過度激活的自噬可以加重腦損傷，抑制自噬有利于局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)組織損傷的恢復(fù)。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)在嚴重腦缺血的大鼠中用自噬抑制劑3-甲基腺苷(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬，可阻止海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生程序性死亡，從而有助于保護神經(jīng)元， 提示自噬對缺血腦組織具有損傷作用。Gong等[28]人將自噬基因Atg7缺失和正常新生鼠的腦永久性缺血模型對比后發(fā)現(xiàn)Atg7缺失能更有效地減少神經(jīng)元的自噬性死亡，減輕腦損傷，表明抑制自噬具有腦保護效應(yīng)。

3 出血性腦卒中與自噬

出血性腦卒中是由于腦部血管結(jié)構(gòu)異常或非外傷性血管破裂所導(dǎo)致的一類疾病，主要包括腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)及蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)兩種類型。與缺血性腦卒中比較，出血性腦卒中占的比例較小，對它的研究也相對較少。盡管已經(jīng)證實自噬在許多疾病的發(fā)生中起到重要作用，但在出血性腦卒中中的確切影響和作用尚未完全清楚。近年來有研究發(fā)現(xiàn)自噬在出血性腦卒中后細胞的病理生理變化過程中也發(fā)揮了重要作用。Kong等[29]研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3表達水平顯著上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著下調(diào)，Beclin1/ Bcl-2比值增大，說明腦出血可以激活自噬。Sarkar等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生急性損傷時腦白質(zhì)內(nèi)活化的小膠質(zhì)細胞中自噬體增多。Chen等[31]用雷帕霉素處理腦出血小鼠模型后小膠質(zhì)細胞的激活被抑制，TNF-ɑ表達下降，表明自噬可能抑制小膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。因此，研究發(fā)生出血性腦卒中后機體對于自噬的調(diào)節(jié)機制，并通過調(diào)節(jié)自噬干預(yù)腦出血引起的細胞死亡，可能會成為治療出血性腦卒中患者有效的輔助方法。

4 展 望

腦卒中作為發(fā)病率和致殘率較高的一類疾病，可導(dǎo)致嚴重的認知、運動和感覺功能障礙。自噬在兩種不同類型的腦卒中的作用機制不同，其結(jié)果也不盡相同。自噬在腦卒中中到底是扮演損傷還是保護的角色，取決于細胞內(nèi)外的應(yīng)激程度及細胞自噬的內(nèi)部反應(yīng)機制，并且很可能在腦卒中整個進程的不同時段發(fā)揮不同效應(yīng)。因此，通過不同空間、時間動態(tài)觀察以及從多方面、多層次、多角度研究腦卒中后自噬的發(fā)生發(fā)展過程，探索自噬調(diào)節(jié)的信號通路及分子機制，了解自噬在腦卒中不同情況下發(fā)揮的相應(yīng)作用，有助于為以自噬激動或抑制劑調(diào)控自噬為靶點防治腦卒中開辟新思路，也為今后能以不同類型腦卒中、不同個體、不同時間進程等個性化精準治療腦卒中提供可行性。

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