缺血性腦血管病的膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白-D442G的研究

宋金梅

（內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

缺血性腦血管病是各種原因?qū)е碌哪X部血液供應(yīng)障礙，使局部腦組織缺血、缺氧性壞死[1]，國內(nèi)外大量研究證實，該病為多基因遺傳病，對其病因、危險因素、保護因素、基因遺傳學(xué)等的研究，對腦血管的遠期預(yù)防有深遠的意義[2]。臨床上血脂高指膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平升高，高密度脂蛋白被認為是缺血性腦血管病發(fā)病的保護因素[3]。隨著分子生物學(xué)及遺傳學(xué)發(fā)展，動脈粥樣硬化及血脂紊亂等一系列疾病，與基因及遺傳也密切相關(guān)。血脂受多因素影響，膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白（eholesterolestertransferprotein，CETP）在血脂調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。本課題選擇研究CETP的基因位點-D442G基因多態(tài)性對血脂水平的影響，從而研究缺血性腦血管病的保護因素，為該病的基因治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 缺血性腦血管病組

選取2014年1月～2015年12月本院神經(jīng)內(nèi)科收治的缺血性腦血管病患者140例作為缺血性腦血管病組，其中，男97例，女43例，平均年齡（64.74±11.72）歲；全部病例符合第四屆全國腦血管疾病會議制定的《各類腦血管疾病診斷要點》經(jīng)頭顱CT/MRI等影像學(xué)檢查證實診斷，個體間無親緣關(guān)系。排除腦出血、腦栓塞及其他出血病疾病、嚴重凝血功能異常。

1.1.2 對照組

隨機選取本院體檢科健康體檢人員100例作為對照組，其中，男64例，女36例，平均年齡（53.40±10.60）歲；排除腦血管意外及其他嚴重疾病，個體間無親緣關(guān)系。

1.2 實驗方法

1.2.1 血標本的采集

受試者禁食12小時以上，于凌晨7時左右抽取靜脈血3 mL，送我院檢驗科查血生化。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（PCR- RFLP）

PCR-RFLP主要用于檢測基因突變，既可檢測致病基因的堿基突變，又可進行基因的連鎖分析，為以后的基因診斷做準備。實驗原理為某一DNA基因位點突變使得某一堿基置換位點正好與限制性內(nèi)切酶識別位點一致，進而使限制性內(nèi)切酶的酶切位點增加或減少，應(yīng)用PCR法特異擴增含置換堿基的DNA片段，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，電泳分析酶切產(chǎn)物，觀察其變異程度。

1.2.3 CETP D442G基因多態(tài)性分析方法

CETP的D442G多態(tài)位點的PCR擴增引物序列多態(tài)位點引物序列NCBI代號堿基替換D442G上游引5`-TCATGAACA GCAAAGGCGTGAGCCTCTCCG-3`下游引物5′-AGCCAA GCTGGTAGAGGCCCCTCTGTCTGT-3′。

PCR擴增體系反應(yīng)體系同普通的PCR擴增。擴增片段酶切產(chǎn)物檢測D442G位點配置3%的瓊脂糖凝膠，反應(yīng)終止后分別經(jīng)2%瓊脂糖及8%聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。同時用DNA測序鑒定各基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組化驗資料比較

缺血性腦血管病組低密度脂蛋白膽固醇（2.71±0.79）、膽固醇（4.78±1.19）、甘油三酯（2.14±1.03）水平均較對照組（分別為2.51±0.73、4.56±1.18、1.75±1.21）顯著升高，高密度脂蛋白膽固醇（1.29±0.51）較對照組（1.67±0.92）顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 CETP D442G基因多態(tài)性結(jié)果分析

PCR-RFLP瓊脂糖凝膠電泳條帶顯影較清晰，酶切后檢測出，DD基因型、DG基因型、GG基因型，DD野生型出現(xiàn)一條帶（180 bp），DG突變雜合子出現(xiàn)二條帶（180 bp、150 bp），GG突變純合子出現(xiàn)一條帶（150 bp）。

2.3 兩組間CETP D442G基因型及等位基因分布頻率比較

缺血性腦血管病組患者共140例，其中野生型純合子DD型43例，突變純合子GG型52例，突變雜合子DG型45；對照組共100例，DD基因型21例，GG基因型25例，DG基因型54例，缺血性腦血管病組的DG基因型頻率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組間DD、GG基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組G等位基因頻率顯著高于缺血性腦血管病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組間D等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 CETP D442G不同基因型間血脂比較

基因型DG高密度脂蛋白水平（1.65±0.61）顯著高于DD（1.39±1.12）、GG（1.31±0.29）基因型，單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。DD、DG、GG基因型間膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 缺血性腦血管病組危險因素的Logistic回歸分析

以年齡、性別、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三酯，CETP D442G基因型做為自變量，以是否發(fā)生缺血性腦血管病組為應(yīng)變量，建立非條件Logistic回歸模型，選定缺血性腦血管病的保護因素。

結(jié)論：年齡、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白為缺血性腦血管病發(fā)病的獨立危險因素（OR＞1，P＜0.05）；高密度脂蛋白、G等位基因為該病發(fā)病的保護因素（OR＜1，P＜0.05）；吸煙、飲酒史對該病的發(fā)病無明顯意義（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 關(guān)于缺血性腦血管病組的臨床指標

本研究顯示缺血性腦血管病患者的平均年齡顯著高于對照組，吸煙人數(shù)亦高于對照組，甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白水平較對照組增高，高密度脂蛋白低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組間資料具有可比性，故年齡、高血脂、吸煙等因素有可能增加缺血性腦血管病的發(fā)病風險，高密度脂蛋白可能降低了缺血性腦血管病的發(fā)病風險。

3.2 CETP D442G基因多態(tài)性結(jié)果分析

本研究結(jié)果：缺血性腦血管病的突變雜合子DG基因型頻率明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；DG基因型人群的高密度脂蛋白水平明顯高于GG、DD基因型。非條件Logistic回歸分析結(jié)果為突變的G等位基因為缺血性腦血管病發(fā)病的保護基因。其原因可能為突變基因G基因提高高密度脂蛋白，高密度脂蛋白為血管內(nèi)的清道夫，可清除動脈粥樣硬化斑塊，減輕動脈硬化程度，可促進膽固醇等其他脂質(zhì)的代謝，發(fā)揮其抗動脈硬化作用。D442G的突變原因暫不明確，可能與種族及其他基因位點協(xié)同作用有關(guān)。影響高密度脂蛋白代謝的機制也不明確，需要進一步深入研究證實。