AGT基因多態(tài)性與出血性腦卒中的相關性研究

劉文鵬，劉艷，魏燦，于建剛，陳愛民，丁云龍，管清華，趙旭平

腦卒中分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，出血性腦卒中是指非外傷性腦實質內血管破裂而引起的出血，又稱為顱內出血(ICH)，出血性腦卒中預后極差，其死亡率和病殘率高，危害嚴重。由于一直缺乏有效的治療腦卒中的手段，目前認為預防是最好的措施，所以明確哪些因素可能導致出血性腦卒中發(fā)病，并進行積極干預就顯得極為重要。腎素-血管緊張素系統(tǒng)在高血壓和心腦血管疾病的發(fā)生過程中扮演著重要的角色，編碼血管緊張素原的AGT基因與腦卒中的相關性受到越來越多的關注。本研究對出血性腦卒中患者和對照人群中AGT基因上的單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs2067853和rs4762進行了檢測，并分析了兩個SNP位點與出血性腦卒中易感的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2012年6月～2015年3月江蘇省靖江市人民醫(yī)院神經內科入院的ICH患者255例(ICH組)，其中男157例，女98例，平均年齡(64.24±9.32)歲。ICH組的納入標準：診斷均符合全國第四屆腦血管病學術會議通過的診斷標準，并經頭顱CT或MRI檢查證實。排除缺血性腦卒中患者，排除外傷、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤等因素引起的出血性腦卒中患者。另外選擇本院健康體檢者321名作為正常對照組(NC組)，其中男195名，女126名，平均年齡(63.37±3.89)歲。排除標準：腦卒中、肝、肺、腎等器官功能性疾病、血液病、腫瘤、癲癇、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病等和有腦血管病史的人。全部研究對象間無血緣關系，均為漢族，來自江蘇地區(qū)。所有研究對象均同意參加本研究并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料及標本采集 收集和檢測所有對象的如下信息：性別、年齡、體質量指數(shù)(BMI)、吸煙、飲酒、是否患高血壓、糖尿病、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、空腹血糖、糖化血紅蛋白等生理生化指標。血液生化指標測試時，受試者禁食12～14 h后，抽取肘靜脈血約10 ml，加入到乙二胺四乙酸二鉀抗凝試管中，輕輕混勻，置于-20℃冰箱中儲存待用。用全自動生化分析儀測定TC、TG、血糖等血液常規(guī)生化指標。

1.2.2 基因組DNA提取 采集乙二胺四乙酸二鉀抗凝靜脈血5 ml，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用美國Axygen-AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒(Axygen，美國)提取白細胞基因組DNA，提取過程嚴格按照試劑盒說明書進行，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計和合成 AGT基因的引物設計采用Sequenom公司提供的在線多重引物設計程序以及MassARRAYAssay Designer 3.1引物設計軟件包(Sequenom，美國)設計PCR擴增引物、單堿基延伸引物，每個SNP位點對應兩條PCR擴增引物和一條延伸引物。每條PCR引物5′端增加10個堿基的tag：ACG TTG GAT G。用于rs4762 分型PCR上游引物：5′-ACG TTG GAT GAC AAA CGG CTG CTT CAG GTG-3′，PCR下游引物：5′-ACG TTG GAT GAG GGC AGG GCT GAT AGC CA-3′，延伸引物：5′-ccc ttA ACA CGC CCA CCA CC-3′；用于rs2067853分型 PCR上游引物：5′-ACG TTG GAT GGC ACT TTC GTT TGC ACA GTC-3′，PCR下游引物：5′-ACG TTG GAT GAC GTC TTG CCA CAA TAA GCC-3′，延伸引物：5′-tgt cTA CAT CTG TTT GGC TGC TAA AT-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 SNP分型檢測 應用Sequenom公司的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜系統(tǒng)平臺(MALDI-TOF MS)進行rs4762和rs2067853的分型檢測，由上海邃志生物科技有限公司完成。所有需要分型的DNA樣本都進行標準化處理，稀釋到10 ng/μl。樣本依次進行如下操作：(1) 進行PCR擴增：DNA樣本1 μl、水0.95 μl、0.625 μl PCR緩沖液(含15 mmol/L MgCl2)、1 μl的dNTP(2.5 mmol/L)、0.325 μl的MgCl2(25 mmol/L)、1 μl引物混合液(每個位點的上游引物和下游引物濃度分別為1 μmol/L)以及0.5 U 的HotStar Taq酶 (Qiagen)均勻混合。PCR反應條件：94 ℃預變性15 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個循環(huán)； 72 ℃延伸3 min，最后4℃保存。(2)SAP酶消化反應消除多余dNTP：PCR擴增后，用蝦堿性磷酸酶(SAP)消化剩余的dNTP，反應體系包括1.53 μl水、0.17 μl SAP緩沖液和0.3 U SAP酶(Sequenom)，37 ℃40 min 反應，然后85 ℃ 5 min使SAP酶失活，4 ℃保存。(3)單堿基延伸反應：采用Sequenom專用iPLEX試劑盒進行SNP基因型分型檢測。SAP酶處理后，在0.755 μl水、0.2 μl 10× iPLEX緩沖液、0.2 μl終止混合物、0.041 μl iPLEX酶(Sequenom)混合液中加入0.804 μl(每個位點的延伸引物濃度分別為10 μmol/L)的延伸引物。單堿基延伸反應在下列條件下進行：首先第一步94 ℃預變性30 s；其次第二步94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s(其中52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s先進行5個小循環(huán))，第二步變性-退火-延伸共進行40個大循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。(4)交換樹脂進行純化：在終止反應物中加入6 mg陽離子交換樹脂(Sequenom)脫鹽，混合后加入25 μl水懸浮，離心待用。使用MassARRAY Nanodispenser (Sequenom)將最終的分型產物點樣到一塊384孔的spectroCHIP(Sequenom)上，并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行分型分析。最終結果由MassARRAYRT軟件系統(tǒng)(版本號3.0.0.4)進行實時讀取，并由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)(版本號4.0)完成基因分型分析。根據(jù)分子量的不同，rs4762、rs2067853位點的基因型分別讀取為CC、CT、TT三種基因型。

2 結 果

2.1 ICH組與對照組一般臨床資料的比較 見表1。ICH組和NC組兩組在年齡、性別、TC、TG、LDL-C比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。兩組在BMI、HDL-C、空腹血糖、糖化血紅蛋白、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病方面比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05～0.001)。

2.2 基因分型結果和Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗 在所有的576個樣本中都成功的進行了SNP分型檢測，rs2067853和rs4762位點均檢測到三種基因型：CC、CT、TT。經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，rs2067853和rs4762位點的等位基因和基因型在研究人群中的分布頻率均符合遺傳平衡，具有群體代表性(P>0.05)。

2.3 兩組基因型和等位基因分布頻率的比較 見表2，表3。rs2067853基因型頻率在ICH組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.012)；按照性別進一步分層分析后發(fā)現(xiàn)，男性中rs2067853基因型分布頻率在兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.045)；而在女性中，兩組間頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。rs4762位點基因型和等位基因分布頻率在ICH組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義，按照性別進一步分層分析后，兩組間差異仍無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表1 ICH組與對照組一般臨床資料比較(x±s，例，%，)臨床資料ICH組(n=255)對照組(n=321)年齡(歲)64．24±9．3263．37±3．89男/女157/98195/126BMI(kg/m2)26．32±2．3323．89±1．53??TC(mmol/L)4．74±0．934．72±0．84TG(mmol/L)1．65±1．701．51±0．93HDL?C(mmol/L)1．33±0．321．27±0．26?LDL?C(mmol/L)2．74±0．772．76±0．69空腹血糖(mmol/L)6．24±2．205．37±1．26??糖化血紅蛋白(%)5．88±1．045．26±0．89??吸煙65(25．5)42(13．1)??飲酒49(19．2)17(5．3)??高血壓232(91．0)36(11．2)??糖尿病32(12．5)10(3．1)?? 注：與對照組比較?P<005，??P<0001

表2 兩組rs2067853基因型和等位基因型分布頻率的比較(例，%)分組例數(shù)基因型TTCTCC等位基因TC全部 ICH組25511(4．3)71(27．8)173(67．8)?93(18．2)417(81．8) NC組3212(0．6)89(27．7)230(71．7)93(14．5)549(85．5)女 ICH組984(4．1)28(28．6)66(67．3)36(18．4)160(81．6) NC組1261(0．8)30(23．8)95(75．4)32(12．7)220(87．3)男 ICH組1577(4．5)43(27．4)107(68．2)△57(18．2)257(81．8) NC組1951(0．5)59(30．3)135(69．2)61(15．6)329(84．4) 注：與對照組比較?P<005；與男性對照組比較，△P<005

表3 兩組rs4762基因型和等位基因型分布頻率的比較(例，%)分組例數(shù)基因型TTCTCC等位基因TC全部 ICH組2551(0．4)32(12．5)222(87．1)34(6．7)474(93．3) NC組3213(0．9)45(14)273(85)51(7．9)591(92．1)女 ICH組980(0．0)18(18．4)80(81．6)18(9．2)178(90．8) NC組1261(0．8)17(13．5)108(85．7)19(7．5)233(92．5)男 ICH組1571(0．6)14(8．9)142(90．4)16(5．1)298(94．9) NC組1952(1．0)28(14．4)165(84．6)32(8．2)358(91．8)

2.4 在顯性和隱性兩種遺傳模型下男性中兩組rs2067853基因型分布頻率的比較 見表4。在顯性遺傳模型下，兩組間男性rs2067853基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在隱性遺傳模型下，兩組間基因型分布頻率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014，OR=9.053，95%CI：1.102～74.386)，TT基因型是男性中出血性腦卒中的風險因素。

表4 兩組男性rs2067853基因型分布頻率的比較(例，%)分組顯性模型基因型TT+CTCC隱性模型基因型TTCC+CTICH組50(31．8)107(68．2)7(4．5)150(95．5)△NC組60(30．8)135(69．2)1(0．5)194(99．5) 注：與男性對照組比較△P<005

2.5 腦卒中相關風險因素的Logistic回歸分析 以是否發(fā)生出血性腦卒中為因變量，以性別和基因型的聯(lián)合作用以及高血壓、糖尿病、高密度脂蛋白等有顯著差異的生理生化指標為自變量進行Logistic回歸分析?；貧w分析結果顯示，攜帶rs2067853 TT基因型的男性(OR=16.124，95%CI：1.510～172.164)、高血壓(OR=63.385，95%CI：32.778～122.573)、血糖(OR=1.306，95%CI：1.017～1.676)、糖化血紅蛋白(OR=1.621，95%CI：1.042～2.521)、BMI(OR=1.742，95%CI：1.478～2.054)是出血性腦卒中的風險因素。

3 討 論

研究[1]發(fā)現(xiàn)，高血壓是出血性腦卒中發(fā)生的主要危險因素，因此降壓治療對預防卒中發(fā)病和復發(fā)尤為重要。腎素-血管緊張素系統(tǒng)在血壓調節(jié)及高血壓的形成上具有十分重要的作用。高血壓是腦卒中的危險因素，遺傳因素在出血性腦卒中的發(fā)生過程中起了非常重要的作用。血管緊張素原是一種主要在肝臟合成的大分子球蛋白，是腎素作用的唯一底物。血管緊張素原是血管緊張素肽的前體，是腎素-血管緊張素系統(tǒng) (RAS) 的一種限速底物[2]。血管緊張素原經過兩步反應轉化為活性物質血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，AngⅡ作用于靶器官(如腎、腎上腺、血管等)受體而發(fā)揮生理效應。在正常情況下，RAS對心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育、心血管功能穩(wěn)態(tài)、電解質和體液平衡的維持、以及血壓的調節(jié)均有重要作用。而高濃度的AGT長期刺激RAS系統(tǒng)可導致增加心血管疾病的患病傾向[3]。人類AGT基因定位于lq42-43區(qū)段，編碼AGT，AGT基因的SNP與高血壓的發(fā)生相關。我國學者李立新等[4]研究發(fā)現(xiàn)，高血壓是出血性腦卒中發(fā)生的主要危險因素，因此本研究對AGT基因上SNP與出血性腦卒中易感的相關性進行了探討。

rs2067853是AGT基因上3′端的C→T突變，不改變氨基酸，位于調控區(qū)。rs4762位點是第2外顯子上620位核苷酸C→T突變，導致第207位氨基酸由蘇氨酸變成蛋氨酸，即Thr207Met，又稱Thr174Met。2013年Al-Najai等[5]對沙特阿拉伯大規(guī)模人群的研究發(fā)現(xiàn)，rs2067853位點與高血壓和以及心肌梗死的發(fā)生相關，GG基因型的人患高血壓和心肌梗死的風險高于其他基因型。rs4762與高血壓的相關性在不同的研究群體中得出不同的結論。2013年朱旭明等[6]對8個研究群體的Meta分析發(fā)現(xiàn)，黃種人AGT基因T174M多態(tài)性的C等位基因及CC基因型能降低患高血壓的風險。而2014年，Li等[7]對中國北方人群的研究發(fā)現(xiàn)，rs4762與中國人群高血壓的發(fā)生無關。除了對rs4762與高血壓的易感進行了相關研究外，一些研究者還對Thr207Met(又稱Thr174Met)是否與腦卒中易感相關進行了研究。Park等[8]對韓國腦卒中患者的研究發(fā)現(xiàn)，rs4762位點只與出血性腦卒中的發(fā)生相關，與缺血性腦卒中的發(fā)生無關。Stetskaia等[9]對俄國腦卒中患者的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶rs4762M等位基因的個體，患腦卒中的風險是其他基因型的1.86倍，但是這種相關性只出現(xiàn)在女性群體中。我國學者也對rs4762與腦卒中的易感性進行了相關的研究。岳月紅等[10]對高血壓和腦梗死組進行研究發(fā)現(xiàn),174 MT+MM基因型是高血壓的保護因素；但是與腦梗死的發(fā)生無關。而李宏芬等[11]研究發(fā)現(xiàn)，AGT基因174TM基因型和M等位基因可能為腦梗死的易患因素。上述這些研究對于Thr207Met(又稱Thr174Met)的結論在不同人種、不同研究群體、不同疾病、不同性別和不同腦卒中類型中的結論存在差異，甚至得出相反的結論。本研究探討了這些SNP位點與中國漢族人群出血性腦卒中易感是否存在相關性發(fā)現(xiàn)，無論是男性還是女性中rs4762(Thr207Met)與出血性腦卒中的發(fā)生無關。與Park等[8]在韓國人群中的研究結果不同，這種差異可能是由于人種不同導致的。而AGT基因上的另外一個位點rs2067853則與出血性腦卒中的發(fā)生相關，但是這種相關性只出現(xiàn)在男性患者中。推測性別在RAS系統(tǒng)影響腦卒中的發(fā)生過程中可能存在一定的調節(jié)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，男性中rs2067853位點是以隱性遺傳模型的方式影響出血性腦卒中的發(fā)生風險，TT基因型的發(fā)生風險是其他基因型的9.053倍(調整后OR=16.124)，說明該位點對腦卒中易感風險的影響要達到一定的基因劑量效應。本研究指出AGT基因上的rs2067853位點與中國漢族人群出血性腦卒中的易感相關，該研究結果為評估腦卒中的發(fā)生風險提供了一定的研究基礎。但AGT基因上的SNP多態(tài)性位點很多，并且目前研究群體數(shù)量相對較少，需要進行更多SNP位點、更大規(guī)模樣本人群的研究來明確AGT基因與出血性腦卒中易感的相關性。同時更要綜合考慮其他基因、生理生化指標以及環(huán)境因素等多方面因素對出血性腦卒中發(fā)生風險的影響。

本研究揭示了AGT基因與出血性腦卒中發(fā)生的相關性，結果表明AGT基因的不同位點突變對AGT基因的功能產生不同的影響。AGT基因在RAS系統(tǒng)中起著非常重要的作用，可能通過某種性別相關的機制影響了出血性腦卒中的發(fā)生。AGT基因或者基因上的SNP位點通過哪些作用機制與哪些因素共同作用影響了腦卒中的發(fā)生，目前還不十分明確，后續(xù)還需要進行更多的功能學方面的研究來進一步探索和挖掘相關的機制。

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