耐亞胺培南的腸桿菌科細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀及機(jī)制

俞丁寧 胡銘斐 王科枰 周芳美?

作者單位：310000 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院

腸桿菌科細(xì)菌是寄居腸道的正常菌群，菌群失調(diào)時易造成尿路感染、血液感染等疾病，是醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的重要來源之一。亞胺培南為碳青霉烯類藥物，抗菌能力強(qiáng)，臨床上常把其作為多重耐藥菌感染患者治療的最后選擇［1］。隨著抗生素的廣泛使用，腸桿菌科細(xì)菌對亞胺培南出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，且耐藥率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，這限制了臨床用藥，威脅著人類的健康。近幾年“超級細(xì)菌”感染人數(shù)的增加，更是令人們對其擔(dān)憂。而研究腸桿菌科細(xì)菌對亞胺培南的耐藥機(jī)制，對控制感染性疾病的發(fā)生及臨床治療均有重要意義。

1 耐藥現(xiàn)狀

2017年耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌被世界衛(wèi)生組織劃分為“1類重點(diǎn)病原體”，可見其對人類健康危害之大。北京協(xié)和醫(yī)院［2］與2016年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)［3］均顯示耐亞胺培南的肺炎克雷伯菌近年來檢出率明顯上升，其中以ICU患者尤甚，可能是由于重癥患者的病情需要用更大劑量的抗生素來控制所造成的。衛(wèi)計委全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（Mohnarin）2015-2016年革蘭陰性菌耐藥監(jiān)測報告［4］中顯示，腸桿菌科細(xì)菌對亞胺培南普遍存在抗性，其中肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌對亞胺培南的耐藥率在最近幾年內(nèi)上升較快，需引起高度關(guān)注。

美國CDC在2011～2014年有關(guān)疾病控制的報告［5］中顯示腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類藥物耐藥率略有增加，以克雷伯菌屬和大腸埃希菌尤甚，如尿路感染分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥率自2011年至2014年分別為10.7%、9.1%、10.9%、9.5%，均保持在10%的較高水平。EARS-Net 2016年報告［6］的歐洲耐碳青霉烯類大腸埃希菌檢出率＜1%，但耐藥肺炎克雷伯菌分離株檢出率較高。上述數(shù)據(jù)分析可見，耐亞胺培南等碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細(xì)菌在不同地區(qū)都普遍存在，但耐藥菌的流行分布不同，其中耐藥肺炎克雷伯菌的檢出率在世界范圍內(nèi)都較高，督促醫(yī)療機(jī)構(gòu)需要采取更積極的措施以防止耐藥菌株的爆發(fā)。

2 耐藥機(jī)制

腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素亞胺培南耐藥的機(jī)制主要有四個方面，分別是產(chǎn)碳青霉烯酶、膜孔蛋白的丟失與改變、主動外排作用增強(qiáng)及青霉素結(jié)合蛋白的改變［7］。

2.1 產(chǎn)碳青霉烯酶 細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥，很重要的原因是產(chǎn)生了碳青霉烯酶使藥物滅活。碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少亞胺培南或者美羅培南的一類β-內(nèi)酰胺酶。腸桿菌科細(xì)菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌等菌株能夠產(chǎn)生許多滅活碳青霉烯酶類抗生素的酶，該酶按照Ambler分類分為四類，其中A、B、D三類被認(rèn)為是碳青霉烯酶［8］。（1）A類碳青霉烯酶： A類碳青霉烯酶主要包括NmcA，KPC、SME，IMI-1/2、GES等，是一種絲氨酸碳青霉烯酶，能夠使碳青霉烯類、青霉素類、氨曲南類等多種抗生素水解滅活。克拉維酸能夠抑制A類酶的活性，但其活性不被乙二胺四乙酸抑制［8］。1996年Yigit等［9］從一株耐藥的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了KPC酶。之后，美國、以色列、法國、中國等國家相繼在多種腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了這種酶。KPC酶有多種亞型，而在中國，耐亞胺培南的細(xì)菌主要產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶［10］。產(chǎn)KPC酶是細(xì)菌獲得耐藥性的重要原因之一。Li等［11］發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌獲得KPC-2基因后，對亞胺培南的耐藥性顯著增加。Su 等［10］通過基因測序粘質(zhì)沙雷菌產(chǎn)生的KPC-2與大腸埃希菌的共培養(yǎng)物，再次證實(shí)了KPC-2對亞胺培南耐藥的作用。產(chǎn)KPC酶的菌株容易引起流行，這是因bla KPC基因位于可接合的質(zhì)粒上，與轉(zhuǎn)座子Tn4401結(jié)合，兩側(cè)的插入序列可以跟隨轉(zhuǎn)座子實(shí)現(xiàn)在不同菌株間的轉(zhuǎn)移，其中ST -258序列有助于bla KPC基因的擴(kuò)散［12］。這種傳播機(jī)制明顯加快細(xì)菌耐藥性的傳播。此外，在耐亞胺培南的腸桿菌科細(xì)菌中還發(fā)現(xiàn)較多其他A類酶，如NmcA、GES酶等，其中GES存在多種有水解活性的變異體，以GES-5對亞胺培南水解活性最強(qiáng)［13-14］。由此可見，酶發(fā)生變異，產(chǎn)生新的衍生物是近年來腸桿菌科細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)的重要原因之一。（2）B類碳青霉烯酶：B類碳青霉烯酶為金屬酶，主要包括VIM、IMP、NDM-1等，可以水解除氨曲南之外的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，其活性能被乙二胺四乙酸抑制，但不受到克拉維酸的抑制［8］。從粘質(zhì)沙雷菌中分離第一個IMP-1到現(xiàn)在，已知的IMP酶變異體有48種，我國較為常見的為IMP-4，其通過質(zhì)粒在菌株間傳播，引起流行［15］。而目前產(chǎn)NDM-1的耐藥腸桿菌科細(xì)菌是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)，因為其能表達(dá)多種藥物滅活酶，引起細(xì)菌多重耐藥，嚴(yán)重限制了臨床用藥［16］。此外，腸桿菌科耐藥菌株中IMP-1、IMP-2、VIM等的檢出預(yù)示B類碳青霉烯酶在臨床上的流行［17］。B類金屬酶對亞胺培南的水解作用是三類中最強(qiáng)的［7］，其又通過質(zhì)粒擴(kuò)散，引起產(chǎn)B類酶細(xì)菌的強(qiáng)耐藥性和多重耐藥，應(yīng)該加強(qiáng)控制。（3）D類碳青霉烯酶：D類碳青霉烯酶中的OXA酶中只有少數(shù)類型對亞胺培南有水解活性，在耐藥腸桿菌科細(xì)菌中流行的主要為OXA-48樣碳青霉烯酶，其對亞胺培南具有很高的水解活性［12］。編碼OXA-48的基因通過質(zhì)粒在腸桿菌科細(xì)菌之間傳播。目前國外發(fā)現(xiàn)了一種新型的OXA-48的衍生物OXA-162，bla OXA-162基因位于由兩個IS1999-2元件組成的攜帶轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒上，其能夠提高對亞胺培南的水解活性［18］，這是酶發(fā)生變異后，提高原有活性的又一個例子。

2.2 膜孔蛋白的丟失與改變 革蘭陰性桿菌的細(xì)胞膜中鑲嵌著膜孔蛋白，允許大多數(shù)抗菌藥物跨膜進(jìn)入菌體，影響著細(xì)胞膜的通透性。細(xì)胞膜的通透性與酶的作用共同影響著耐藥效益。肺炎克雷伯菌與亞胺培南耐藥有關(guān)的膜孔蛋白主要為OmpK35和OmpK36，其作用相當(dāng)于大腸埃希菌的OmpF和OmpC［19］，若這兩種膜孔蛋白表達(dá)下調(diào)或者功能改變，會降低藥物的抑菌作用。Ye等［19］用SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)耐藥的腸桿菌科細(xì)菌與敏感菌株相比Omp蛋白下調(diào)。最近，韓國學(xué)者［20］通過 ERIC-PCR分析，發(fā)現(xiàn)在所有亞胺培南耐藥的腸桿菌科細(xì)菌中，膜孔蛋白o(hù)mpK35基因的表達(dá)均下調(diào)。此外，也有研究［21］證明膜孔蛋白下調(diào)合并滅活酶產(chǎn)生也是腸桿菌科細(xì)菌對亞胺培南耐藥的影響因素之一。由此可見，OmpK35/36 膜孔蛋白表達(dá)的單獨(dú)下調(diào)或合并滅活酶的共同作用是腸桿菌科對亞胺培南的敏感度下降的重要原因之一。

2.3 主動外排作用增強(qiáng) 主動外排系統(tǒng)是存在于細(xì)菌中的一組能將菌體內(nèi)藥物或其他物質(zhì)排出體外的外排泵，能使達(dá)到作用位點(diǎn)的藥物濃度下降而產(chǎn)生耐藥性。其中，與腸桿菌科細(xì)菌耐碳青霉烯類藥物有關(guān)的外排泵主要AcrAB-ToIC系統(tǒng)。臨床分離的耐藥大腸埃希菌通過分析發(fā)現(xiàn)AcrAB-ToIC外排泵基因表達(dá)上調(diào)而膜孔蛋白表達(dá)下調(diào)，使膜通透性下降［22］。由此可見，細(xì)菌細(xì)胞膜對抗生素的通透性與外排作用是相對的，膜通透性下降合并外排作用增強(qiáng)會導(dǎo)致菌體內(nèi)藥物濃度下降，細(xì)菌對藥物敏感性降低。但也有研究發(fā)現(xiàn)外排泵基因AcrB的表達(dá)上調(diào)與細(xì)菌對亞胺培南耐藥無關(guān)［20］。目前對于外排泵系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制研究還不夠深入，需要進(jìn)一步探索，以解決由于外排作用而導(dǎo)致的耐藥問題。

2.4 青霉素結(jié)合蛋白的改變 青霉素結(jié)合蛋白（Penicillin binding proteins，PBPs）是幾乎存在于所有細(xì)菌內(nèi)膜的一組有催化功能的酶，其能參與合成細(xì)胞壁和維持細(xì)胞形態(tài)［23］。當(dāng)抗菌藥物與PBPs結(jié)合后，會抑制PBPs的酶活性，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

在腸桿菌科中，對大腸埃希菌的PBPs的研究開展的最早。目前已知的大腸埃希菌的PBPs有12種。亞胺培南主要與PBP2及PBP3結(jié)合，其與PBP2結(jié)合后使細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生改變，最終細(xì)菌溶解死亡；與PBP3結(jié)合后，能抑制大腸埃希菌的分裂［23］。除此之外，也有研究認(rèn)為大腸埃希菌耐藥與PBP5的改變有關(guān)［24］。因此，PBPs如發(fā)生突變，藥物與作用靶位結(jié)合的親和力下降，最終表現(xiàn)為細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性降低。

除了上述機(jī)制在腸桿菌科細(xì)菌耐藥效益中的作用突出，另外，靶酶和競爭性靶酶底物合成上調(diào)、耐藥基因及生物被膜的產(chǎn)生等也會影響細(xì)菌耐藥［25-26］，但這些機(jī)制中有關(guān)亞胺培南耐藥的腸桿菌科細(xì)菌的研究目前還不多，需要未來更加努力的探索。

3 耐藥對策

3.1 抗生素的使用管理 耐藥性的產(chǎn)生和變化大多起因于抗生素的濫用［12］。濫用抗生素使細(xì)菌發(fā)生變異，最終導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生和傳播。細(xì)菌的耐藥檢測可以為臨床抗生素的使用提供可靠的數(shù)據(jù)，因此加強(qiáng)耐藥檢測，合理利用抗生素便顯得尤為重要。對于多重耐藥菌［27］，更要注重控制院內(nèi)感染和交叉感染的發(fā)生，如發(fā)生則要及時隔離患者、加強(qiáng)院內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生、做好院內(nèi)人員個人衛(wèi)生宣傳等減少耐藥菌感染的流行。

3.2 聯(lián)合用藥 有研究發(fā)現(xiàn)［28］，有些既有抗菌藥物同其他抗菌藥物聯(lián)合使用，治療效果明顯優(yōu)于其單藥治療效果，如多粘菌素、磷霉素等，與其他抗菌藥物一同使用時，可明顯增強(qiáng)抗菌活性，延緩耐藥菌的出現(xiàn)。雖然大多研究認(rèn)為［28-29］使用聯(lián)合治療耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細(xì)菌效果優(yōu)于單藥治療，但仍需進(jìn)一步的研究驗證。

3.3 新藥研發(fā) 研發(fā)新型藥物治療感染勢在必行。目前已證實(shí)［29］有效的耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細(xì)菌新藥主要有碳青霉烯酶抑制劑復(fù)方制劑、甘酰胺環(huán)素、新型頭孢菌素等，這幾類藥物主要通過抑制細(xì)菌蛋白合成、抑制酶產(chǎn)生、抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成等機(jī)制發(fā)揮抗菌作用。新藥的研發(fā)不僅可以從這幾方面繼續(xù)深入研究，也有望從改變藥物作用靶位或使用脂質(zhì)體作為藥物載體等方向進(jìn)行研究，以避免外排作用等因素對藥效的影響。

外排泵抑制劑能降低外排泵基因的表達(dá)，在一定程度上增加抗生素的敏感性，達(dá)到治療的目的。目前有關(guān)治療耐亞胺培南的腸桿菌科細(xì)菌感染的外排泵抑制劑的研究不多，國內(nèi)外已知外排泵抑制劑主要有三酸鹽、維拉帕米等［30］，但由于該類藥物使用劑量對身體的副作用大，并未成功應(yīng)用于臨床。有研究證明［31］連翹酯苷B對治療外排泵介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥也有效，因此可以從中藥入手，充分發(fā)揮中藥對于機(jī)體的調(diào)理作用，探索新的治療途徑。

4 展望

腸桿菌科細(xì)菌對于亞胺培南的耐藥性有地區(qū)差異性，但在世界范圍內(nèi)總體呈上升趨勢。腸桿菌科細(xì)菌耐亞胺培南的機(jī)制不是單一的，是多種機(jī)制間相互作用的結(jié)果，如細(xì)菌膜孔蛋白合成下調(diào)合并滅活酶的產(chǎn)生、細(xì)菌膜通透性下降合并主動外排作用增強(qiáng)或青霉素結(jié)合蛋白親和力下降等。同時細(xì)菌產(chǎn)生的滅活酶可以發(fā)生變異，一些變異體的產(chǎn)生加強(qiáng)了細(xì)菌的耐藥性，其能通過質(zhì)粒在菌株傳播，加速耐藥性的擴(kuò)散。腸桿菌科細(xì)菌耐藥性的擴(kuò)散以及新藥研發(fā)緩慢，給臨床帶來困難，展望未來，通過對腸桿菌科細(xì)菌耐藥性研究的深入，研究者們會發(fā)現(xiàn)更多安全有效的策略來解決腸桿菌科細(xì)菌耐藥的問題。