CAR-T細(xì)胞免疫療法的研究進展

榮 斌，原 野，吳純啟，李曉旭，王全軍*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 昆明 650504；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒物藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，國家北京藥物安全評價研究中心，北京 100039）

嵌合抗原受體（CAR，Chimeric antigen receptor）-T細(xì)胞免疫療法是一種腫瘤過繼細(xì)胞免疫療法，基本原理是利用基因工程修飾T淋巴細(xì)胞，使其表達嵌合抗原受體，以非MHC（major histocompatibility complex，主要組織相容性復(fù)合體）限制性的方式殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR的優(yōu)點在于能非MHC依賴性識別腫瘤蛋白質(zhì)和脂類抗原，不需要經(jīng)過抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC），目前已經(jīng)發(fā)展到第四代，早期主要用于治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL），慢性淋巴細(xì)胞性白血病和B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤[2]，近年來也用于治療實體瘤、HIV等。雖然CAR-T細(xì)胞在臨床試驗中取得了顯著的效果，但同時也出現(xiàn)了諸多安全性問題，包括細(xì)胞因子釋放綜合征、腫瘤溶解綜合征、神經(jīng)毒性和脫靶效應(yīng)等[3]。

1 CAR-T細(xì)胞免疫療法及原理

1.1 CAR-T設(shè)計原理

正常T細(xì)胞的活化有賴于雙信號：第一信號由TCR識別APC表面的抗原肽-MHC復(fù)合物（p-MHC）啟動；第二信號由T細(xì)胞和APC間共刺激分子的相互作用啟動（即B7/CD28協(xié)同刺激信號）[4]。而CAR-T細(xì)胞技術(shù)的設(shè)計原理是使T細(xì)胞不需要依賴MHC分子和APC，將識別腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的單鏈抗體（scFv）、跨膜的共刺激結(jié)構(gòu)域（如CD28和CD4-1BB）和T細(xì)胞的活化基序結(jié)合為一體，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞，經(jīng)基因修飾的T細(xì)胞通過表達單鏈抗體增強結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力，同時激活T細(xì)胞，使其增殖并激活其細(xì)胞毒活性，使其能特異性地識別和殺傷腫瘤細(xì)胞[5]。

1.2 CAR結(jié)構(gòu)

CAR基本結(jié)構(gòu)（即第一代CAR結(jié)構(gòu)）包括胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域是由單克隆抗體的重鏈和輕鏈的抗原結(jié)合區(qū)組成的單鏈可變片段（scFv），能夠識別特定的腫瘤抗原；跨膜結(jié)構(gòu)域有CD4、CD7、CD8、CD28 和 CD3ζ等蛋白分子；胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域為T細(xì)胞受體TCR/CD3ζ鏈或免疫球蛋白Fc 受體FcεRIγ鏈，含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs），可發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[6]。

隨后的CAR大多遵循相同的結(jié)構(gòu)模式，第1代CAR在胞內(nèi)只有1個T細(xì)胞CD3ζ受體的信號區(qū)；第2代CAR增加了1個共刺激分子信號〔如CD27、CD28、OX40、可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible costimulatory molecule，ICOS）或CD137（4-1BB）等〕，可實現(xiàn)協(xié)同刺激分子和細(xì)胞內(nèi)信號的雙重活化，使T細(xì)胞持續(xù)增殖并釋放細(xì)胞因子，提高T細(xì)胞的抗腫瘤能力；第三代增加了2個共刺激分子信號，相比第二代，可使T細(xì)胞持續(xù)活化增殖，增強殺傷腫瘤細(xì)胞作用。目前，用于臨床治療研究的主要為第2代和第3代CAR-T細(xì)胞技術(shù)，其中用來攜帶CAR的載體主要來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。第四代CAR（或TRUCKs）在前三代的基礎(chǔ)上增加了一個或多個可以編碼CAR及其啟動子的載體，在T細(xì)胞激活時可以產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子（如IL-12），從而調(diào)節(jié)局部微環(huán)境并輔助CAR-T細(xì)胞功能。

1.3 CAR的表達

外源基因?qū)爰?xì)胞中通常需要運輸工具，因此，將CAR基因整合到T細(xì)胞中（即轉(zhuǎn)染）使其成功表達于T細(xì)胞表面需要借助特殊的方法，包括病毒法和非病毒法[7]。病毒類載體如復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒（γ逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒）可以通過病毒整合酶的作用，將其逆轉(zhuǎn)錄到T細(xì)胞DNA中，從而成為該細(xì)胞基因組的一部分。但是，由于良好操作規(guī)范下的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)耗費時間且費用昂貴，因此有些研究小組采用非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法來實現(xiàn)永久性轉(zhuǎn)導(dǎo)，如采用特定的基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)，包括“睡美人”（Sleeping Beauty，SB）轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[8]和piggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子[9]。但是，通過這些方法成功表達CAR的T細(xì)胞需要在體外擴增到足夠的數(shù)量才能輸入體內(nèi)產(chǎn)生治療效果。

2 CAR-T細(xì)胞免疫療法的臨床應(yīng)用

過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療（adoptive cell transfer therapy，ACT），是指從腫瘤患者中分離免疫活性細(xì)胞，在體外進行擴增和功能鑒定，然后向患者轉(zhuǎn)輸，從而直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體的免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細(xì)胞。ACT包括非特異性免疫治療和特異性免疫治療，CAR-T細(xì)胞免疫療法屬于后者。接受CAR-T細(xì)胞免疫療法的患者，需要從其體內(nèi)分離免疫T細(xì)胞，利用基因工程將CAR表達于T細(xì)胞；然后進行體外培養(yǎng)，大量擴增CAR-T細(xì)胞，一般一個病人需要幾十億，乃至上百億個CAR-T細(xì)胞；最后把擴增好的CAR-T細(xì)胞輸回病人體內(nèi)，嚴(yán)密監(jiān)護病人。

2.1 CAR-T細(xì)胞免疫療法在B細(xì)胞淋巴瘤中的應(yīng)用。

2.1.1 非霍奇金淋巴瘤

CAR-T細(xì)胞免疫療法的早期臨床試驗主要集中在治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）。貝勒醫(yī)學(xué)院（BCM）、希望之城和弗雷德哈欽森癌癥研究中心（FHCRC）[7]等研究團隊和Memorial Sloan Kettering癌癥中心（MSKCC）的研究組[8]以及Savoldo等人[9]證明了用靶向CD19的含有CD28共刺激結(jié)構(gòu)域的第二代CAR-T細(xì)胞免疫療法治療慢性淋巴細(xì)胞性白血?。–LL）或濾泡性淋巴瘤取得了較好的療效，且第二代CAR明顯促進了T細(xì)胞的擴增、增強了T細(xì)胞持久性。盡管總體療效較好，但偶爾出現(xiàn)的毒性反應(yīng)如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）說明CAR-T細(xì)胞免疫療法需要進一步評估。

近兩年的各項研究正逐步改善早期臨床試驗中治療NHL出現(xiàn)的各項問題。在FHCRC研究人員的最新一項臨床試驗中[9]，34名復(fù)發(fā)/難治性NHL的患者接受19BBz CAR治療。絕大多數(shù)患者有彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL，n=18），其余為濾泡型淋巴瘤（n=6），CLL（n=6）或套細(xì)胞淋巴瘤（n=4）。注入的CD19 CAR-T細(xì)胞具有確定的亞群，即比例為1:1的CD8+T中央型記憶細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞。他們還比較了用環(huán)磷酰胺＋氟達拉賓或環(huán)磷酰胺（沒有氟達拉賓）的預(yù)處理方案，結(jié)果顯示：用氟達拉濱和環(huán)磷酰胺治療的患者中，CAR-T細(xì)胞的持久性和擴增性增加，且與僅用環(huán)磷酰胺治療的患者相比，CR率得到改善。在由FHCRC治療的最佳預(yù)處理方案的隊列中，DLBCL的CR率為38%（3/8），濾泡性淋巴瘤的CR率為67%（2/3）。此外，CLL的CR率為50%（n=3/6），表明CLL早期試驗的結(jié)果得到改善，最有可能的原因是改善了調(diào)節(jié)化療。他們還證明了由于細(xì)胞介導(dǎo)的抗鼠scFv T細(xì)胞應(yīng)答導(dǎo)致CAR T細(xì)胞持續(xù)性差的潛在原因。因此，在調(diào)節(jié)化療中加入氟達拉濱的益處是使對CAR的宿主T細(xì)胞免疫應(yīng)答最小化。UPENN研究人員在由Kite Pharma贊助的I/II期臨床試驗中[11]再次證實DLBCL對19-28zCAR-T細(xì)胞敏感。

自從首次報道針對非霍奇金淋巴瘤的CAR-T細(xì)胞免疫療法的8年以來，諸多研究小組經(jīng)過不懈努力，他們的累積研究工作已經(jīng)確定了一個更優(yōu)化的的調(diào)理化療方案、有效和安全的CAR-T細(xì)胞劑量范圍以及最佳的CAR設(shè)計方案。盡管取得了這些成功，但其他類型的NHL仍然有更多的工作要做，比如CLL。由于不適宜的腫瘤微環(huán)境，這種疾病可能對免疫干預(yù)更具抵抗力，或者來自這些患者的T細(xì)胞可能比其他B細(xì)胞惡性腫瘤持續(xù)受損更嚴(yán)重，需要進一步優(yōu)化預(yù)處理方案。

2.1.2 B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病

國內(nèi)對CAR-T細(xì)胞免疫療法治療急性B淋巴細(xì)胞白血病的研究取得了巨大進展。根據(jù)第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院血液科的臨床觀察[12]，2015年4月～2016年1月期間，3例復(fù)發(fā)/難治性急性B淋巴細(xì)胞白血病患者采用CAR-T細(xì)胞治療。3例患者均為多次誘導(dǎo)化療不能達到完全緩解，或復(fù)發(fā)后再次誘導(dǎo)治療無效。均采集自體外周血T淋巴細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)?；剌斍耙苑_拉濱+環(huán)磷酰胺方案預(yù)處理，回輸CAR-T細(xì)胞數(shù)量為0.97至1.0×106/kg。結(jié)果2例患者在CAR-T細(xì)胞輸注后1月內(nèi)達到完全緩解，1例患者無效。達到緩解的2例患者在CAR-T細(xì)胞治療后的第3和第6個月復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)后的1例患者出現(xiàn)CD19陰性克隆復(fù)發(fā)；在整個治療過程中，未發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此得出結(jié)論：CAR-T細(xì)胞可以有效的治療復(fù)發(fā)/難治CD19抗原陽性急性淋巴細(xì)胞白血病，能夠降低耐藥患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，甚至達到完全緩解。

2.2 CAR-T細(xì)胞免疫療法在實體瘤中的應(yīng)用

CAR-T細(xì)胞免疫療法在治療血液腫瘤方面取得了顯著的成功，尤其是CD19-CARs在治療急性和慢性B淋巴細(xì)胞白血病和患有淋巴瘤和惡性腫瘤的患者的臨床試驗中均顯示出良好的治療效果。目前越來越多的臨床試驗集中在實體瘤，靶向表面蛋白包括癌胚抗原（CEA）、糖基化血紅蛋白GD2、間皮素、白細(xì)胞介素13受體α（IL-13Rα）、人表皮生長因子受體2（HER2）和（FAP）和L1細(xì)胞粘附分子（L1CAM）等。

2.2.1 神經(jīng)母細(xì)胞瘤

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童最常見的顱外實體瘤，主要起源于腎上腺，NB發(fā)病早、惡性程度高、預(yù)后差，傳統(tǒng)的手術(shù)切除、放療、化療以及造血干細(xì)胞移植等多重療法介入，NB患兒總體生存率已有所提高，但高?；純号R床預(yù)后仍不佳，因此CAR-T細(xì)胞免疫療法有望成為較好的治療備選方案。

神經(jīng)節(jié)苷脂GD2作為腫瘤相關(guān)糖類抗原，與腫瘤的增殖、擴散、血管生成、代謝、免疫相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，GD2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中呈高密度表達，而在其他神經(jīng)源性腫瘤低密度表達，因此GD2-CAR-T細(xì)胞免疫療法已在臨床試驗中作為治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的最佳方案。Chrystal U. Louis等合成了GD2-CAR-T細(xì)胞治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者，且在EBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（EBV-CTL）和活化T細(xì)胞（ATC）中表達了兩種可以區(qū)分形式的CAR，在之前的研究中他們已證實：表達GD2-CAR（CAR-CTL）的EBVCTL在灌注早期比GD2-CAR ATC（CAR-ATC）有更高水平的傳播。在他們最新的研究中，報道了19例高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者輸注GD2-CAR-T細(xì)胞的長期臨床和免疫學(xué)結(jié)果：輸注緩解8例，活動性疾病11例。11例活動性疾病患者中有3例完全緩解。因此，GD2-CAR-T細(xì)胞免疫療法治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤效果良好。

2.2.2 惡性黑色素瘤

惡性黑色素瘤（malignantmelanoma）是起源于胚胎期神經(jīng)嵴的惡性腫瘤，其惡性度極高，預(yù)后差，以皮膚惡性黑色素瘤最常見。針對惡性黑色素瘤的手術(shù)治療，即使進行早期進行根治手術(shù)，患者5年生存率也低于70%，晚期患者5年生存率僅5%-10%。因此，越來越多的科學(xué)家將關(guān)注點放在CAR-T細(xì)胞免疫療法應(yīng)用于治療惡性黑色素瘤上。

黑色素瘤攜帶大量突變基因，其表達的腫瘤新抗原可以被患者的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)識別，因此近年來新抗原被確定為潛在靶標(biāo)。在Efrat Merhavi-Shoham等科學(xué)家進行的ACT治療惡性黑色素瘤試驗[13]結(jié)果中顯示：使用VEGFR2-CAR-T細(xì)胞的ACT的24名患者中，緩解率為4%。目前正在進行GD2-CAR-T細(xì)胞治療黑色素瘤的I期臨床試驗。

3 CAR-T細(xì)胞免疫療法的毒性

3.1 腫瘤靶向毒性

造成腫瘤靶向毒性的原因是攜帶CAR的T細(xì)胞快速、大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的炎性細(xì)胞因子短時間內(nèi)迅速釋放，造成細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine-release syndrome，CRS），癥狀以寒顫、發(fā)熱為主。同時，由于CAR成功結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的靶抗原，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放，從而造成以高鉀、高磷、高尿酸、低鈣癥狀為主的腫瘤溶解綜合征（Tumor lysis syndrome，TLS）[14]。第二代CD19-CAR-T細(xì)胞臨床試驗中，患者出現(xiàn)發(fā)熱、低血壓、譫妄現(xiàn)象等癥狀，可能與T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥、釋放大量炎性因子(如IL-6)有關(guān)[15]。

3.2 非腫瘤/靶向毒性

CAR識別的抗原多為腫瘤相關(guān)抗原（Tumor associated antigen，TAA），而腫瘤相關(guān)抗原并非腫瘤細(xì)胞所特有，其在健康組織上也存在不同程度的表達。這種CAR-T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會攻擊正常組織造，這種毒性即非腫瘤靶向毒性，該毒性機制造成的毒性效應(yīng)稱為脫靶效應(yīng)。Beatty等科學(xué)家在治療惡性胸膜間皮瘤、轉(zhuǎn)移性胰腺癌的臨床試驗中表明，脫靶效應(yīng)可造成患者心臟驟停、呼吸衰竭、等副反應(yīng)，原因是間皮素可在正常腹膜、胸膜及心包間皮細(xì)胞上表達，CAR識別了正常組織、細(xì)胞上的間皮素并且對其產(chǎn)生殺傷作用，導(dǎo)致較為嚴(yán)重的后果。

3.3 非腫瘤/靶向外毒性

顧名思義，該毒性即CAR-T細(xì)胞對健康組織、非靶向抗原造成的毒性。該毒性機制最近出現(xiàn)在CAR-T細(xì)胞療法的試驗?zāi)Ｐ椭?，其原理是CAR-T細(xì)胞發(fā)生效應(yīng)后T細(xì)胞的活性持續(xù)下降且存在于體內(nèi)時間較長，從而間接影響體內(nèi)局部微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)，引起毒性效應(yīng)[16]。Kalaitsidou M等科學(xué)家報道了接受CD19靶向的第二代CAR-T細(xì)胞治療的小鼠出現(xiàn)了Th1型的細(xì)胞因子驅(qū)動的急性毒性，同時報道了由于CD4+CAR-T細(xì)胞的慢性活性造成的骨髓細(xì)胞響應(yīng)于Th2型細(xì)胞因子驅(qū)動的慢性毒性，這種慢性毒性導(dǎo)致髓樣細(xì)胞的特異性擴增。最終尸檢證明，受影響的動物呈現(xiàn)脾腫大，淋巴結(jié)充滿肉芽腫樣細(xì)胞；細(xì)胞因子分析顯示Th2細(xì)胞因子水平升高，特別是IL-10和IL-1，并且假定該細(xì)胞因子來源于在次級淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)內(nèi)鑒定的大量CD4+CAR T細(xì)胞。然而受影響的動物基本上沒有CD8+CAR-T細(xì)胞和B細(xì)胞，因此這項研究最終證明了CAR-T細(xì)胞長期在體內(nèi)長期刺激時會存在自身毒性的潛能。

4 結(jié) 語

CAR-T細(xì)胞免疫療法作為近期內(nèi)最熱門的研究領(lǐng)域，F(xiàn)DA在2017年分別受理了諾華和凱特制藥CAR-T療法的生物制品申請，同時，全球第一個CAR-T療法上市；該療法早期主要集中于治療淋巴瘤和白血病，近年來在治療黑色素瘤、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等疾病的臨床試驗中也取得了巨大進展，在腫瘤的過繼細(xì)胞免疫治療方面有著有人的前景。

針對出現(xiàn)的一系列包括細(xì)胞因子釋放綜合征、脫靶效應(yīng)在內(nèi)的較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，國內(nèi)外科學(xué)家也研究出諸多應(yīng)對措施，如導(dǎo)入自殺基因、構(gòu)建抑制性CAR、構(gòu)建雙靶抗原CARs、改變T細(xì)胞輸注途徑等[17]。目前最常用的就是導(dǎo)入“安全開關(guān)”（自殺基因），導(dǎo)入自殺基因即在CAR內(nèi)導(dǎo)入一個共表達的自殺基因，當(dāng)CAR-T細(xì)胞增殖且發(fā)揮效應(yīng)過快時激活自殺基因，誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞凋亡，從而終止治療[19]。常見的自殺基因有誘導(dǎo)型半胱天冬酶9（iC9）基因[18]、編碼單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）[20]。Lihua E. Budde1、Carolina Berger等人的研究團隊激活已用iC9自殺開關(guān)證明導(dǎo)入自殺基因的CAR-T細(xì)胞在體外和體內(nèi)均能有效除去轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，該工作證明了以安全和更有效的方式治療CD20+惡性腫瘤的方法的可行性和前景，并且該研究團隊計劃進行這種方法治療復(fù)發(fā)性無痛性B-NHL的I期臨床試驗[21]。

綜上，在短短幾十年內(nèi)，CAR-T細(xì)胞免疫療法從二十世紀(jì)八十年代晚期首次被人們提出作為一種抗癌策略，到近幾年變成了可實際操作的方案治療難治且致命的腫瘤，彰顯出這一領(lǐng)域的光明前景。在國內(nèi)外科學(xué)家的努力和創(chuàng)新下，CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)必將成為眾多惡性腫瘤患者的福音。