杜氏鹽藻無(wú)菌體系的建立

宋程飛，郝敬云，程蔚蘭，史飛飛，季春麗，李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801）

杜氏鹽藻（Dunaliella sallina）是一種單細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞壁的綠藻，在高鹽環(huán)境下能夠正常生長(zhǎng)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最耐鹽的真核藻種之一[1-3]。鹽藻的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，它合成積累的β-胡蘿卜素可被用作食品添加劑與著色劑、飼料添加劑、復(fù)合維生素制劑、化妝品中的抗氧化劑等[4-5]。此外，鹽藻富含多種氨基酸、微量元素、多糖、蝦青素及甘油等極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的成分。鹽藻還是一種優(yōu)良的生物反應(yīng)器[6-7]，經(jīng)基因工程改良可用于生產(chǎn)多種高值化合物。由于鹽藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、較易培養(yǎng)且自身營(yíng)養(yǎng)豐富，使得其成為微藻研究和規(guī)模化培養(yǎng)開(kāi)發(fā)利用的理想生物種質(zhì)材料[8-9]。與其他真核微藻相比，鹽藻細(xì)胞帶菌少，但在培養(yǎng)過(guò)程中，特別是大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，雜菌污染依然存在，嚴(yán)重影響試驗(yàn)結(jié)果，制約鹽藻商業(yè)化開(kāi)發(fā)利用[10]。

有研究表明，真核藻細(xì)胞對(duì)多種抗生素有較好的耐受性，而鏈霉素有時(shí)還能促進(jìn)一些真核藻類(lèi)的生長(zhǎng)[11]。鹽藻與細(xì)菌極易形成共生體系，不易除去。王長(zhǎng)海等[12-13]報(bào)道了帶菌生長(zhǎng)的鹽藻生長(zhǎng)速度很快，但穩(wěn)定期的時(shí)間卻明顯減少，穩(wěn)定期天數(shù)不到無(wú)菌鹽藻的1/4。穩(wěn)定期是鹽藻細(xì)胞中類(lèi)胡蘿卜素等代謝產(chǎn)物積累的主要時(shí)期。因此，建立杜氏鹽藻無(wú)菌培養(yǎng)體系，進(jìn)而延長(zhǎng)其穩(wěn)定期，對(duì)增加藻細(xì)胞中高附加值天然產(chǎn)物的含量是至關(guān)重要的。

常用的微藻藻種純化方法主要有抗生素法[14]、毛細(xì)管顯微分離法[15-17]、離心洗滌法[18]和稀釋過(guò)濾法[19]等。本研究采用平板稀釋法與抗生素法結(jié)合的方法，從山西運(yùn)城鹽湖水樣中鑒定獲得1株細(xì)胞形態(tài)較為均一的杜氏鹽藻株YC-011，選取6種常用抗生素（卡那霉素、頭孢霉素、氯霉素、鏈霉素、潮霉素和氨芐青霉素），研究其不同劑量對(duì)鹽藻培養(yǎng)體系的除菌效果，并測(cè)試鹽藻細(xì)胞對(duì)抗生素的耐受性。通過(guò)綜合分析各種試驗(yàn)數(shù)據(jù)和參數(shù)，建立鹽藻無(wú)菌培養(yǎng)體系，旨在為優(yōu)質(zhì)鹽藻規(guī)模化培養(yǎng)和開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

藻種：試驗(yàn)所用杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是由分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所在運(yùn)城鹽湖所取水樣中分離純化所得，并命名為YC-011。

抗生素：試驗(yàn)所用的抗生素均購(gòu)自Sigma公司（母液經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌）。

培養(yǎng)基：DM培養(yǎng)基配方（表1），調(diào)節(jié)pH值至7.5左右，121℃，0.1 kPa下滅菌20 min。DM固體培養(yǎng)基在滅菌前加入1%的瓊脂。

表1 DM培養(yǎng)基（母液）配方

2216E細(xì)菌培養(yǎng)基的配方[8]：蛋白胨5 g/L，酵母膏1 g/L，磷酸鐵0.1 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.6～7.8，固體培養(yǎng)基添加15 g/L的瓊脂，121℃，0.1 kPa下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)及純化 首先將采于山西運(yùn)城鹽湖的含藻水樣經(jīng)離心收集藻細(xì)胞，用DM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間，然后對(duì)藻液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?00 μL稀釋液均勻涂布于DM固體培養(yǎng)基表面。將平板正置培養(yǎng)于溫度（24±0.5）℃、光強(qiáng)3 000 lx、光暗比16 h∶8 h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h后將平板倒置。培養(yǎng)至第7天時(shí)，觀察培養(yǎng)基表面單藻落的生長(zhǎng)情況。挑取部分單藻落，用牙簽均勻涂布于載玻片，在顯微鏡下觀察鹽藻細(xì)胞的形態(tài)。挑取形態(tài)均一的單藻落，在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 6種抗生素的除菌試驗(yàn) 滅菌后的DM固體培養(yǎng)基冷卻到室溫后，分別向其中加入不同濃度的卡那霉素、頭孢霉素、氯霉素、鏈霉素、潮霉素和氨芐青霉素6種抗生素，濃度梯度分別為0，50，100，200，300，400 μg/mL，設(shè)置 6 個(gè)重復(fù)，充分混勻后，分裝到9 cm的一次性塑料培養(yǎng)皿中，晾至凝固。取100 μL鹽藻藻液至培養(yǎng)基表面，均勻涂布后密封，培養(yǎng)條件同1.2.1。在該條件下培養(yǎng)至第10天，對(duì)各培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 鹽藻細(xì)胞對(duì)氯霉素、氨芐青霉素和頭孢霉素的敏感性測(cè)定 取抑菌效果較為理想的3種抗生素：氯霉素、氨芐青霉素和頭孢霉素，設(shè)置相應(yīng)的濃度梯度，分別添加到生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的鹽藻藻液中。各抗生素的終濃度梯度設(shè)置為 0，100，200，400，600，800 μg/mL，培養(yǎng)條件同 1.2.1。每天 9：00 和 16：00定時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)藻細(xì)胞的三角瓶，10 d后，觀察藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 紙片擴(kuò)散法檢測(cè)鹽藻藻液中細(xì)菌對(duì)6種抗生素的敏感性 取100 μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的鹽藻藻液，加入2216E液體培養(yǎng)基中，30℃下擴(kuò)大培養(yǎng)約8 h。吸取100 μL該菌液，涂布于2216E固體培養(yǎng)基表面，從分別浸在6種抗生素中的紙片中取4片均勻地貼在同一固體培養(yǎng)基表面，每個(gè)平板設(shè)置6個(gè)重復(fù)。30℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈大小，同種抗生素下，取其抑菌圈直徑的平均值作為最終值。

1.2.5 紙片擴(kuò)散法聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 取1.2.4中抑菌效果較為理想的4種抗生素（氯霉素、頭孢霉素、潮霉素和氨芐青霉素）進(jìn)行聯(lián)合抑菌，取100 μL菌液涂布于2216E固體培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)基平均分為4部分，然后再將從不同抗生素中取出的紙片，對(duì)稱(chēng)地貼于同一培養(yǎng)基表面，30℃下培養(yǎng)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.6 鹽藻藻液多次除菌試驗(yàn) 滅菌后的DM固體培養(yǎng)基冷卻到室溫后，添加的抗生素為50 μg/mL氯霉素、100 μg/mL氨芐青霉素和 100 μg/mL頭孢霉素，充分混勻后，分裝到直徑為9 cm的一次性塑料培養(yǎng)皿中，冷卻至凝固。將鹽藻藻液均勻涂布在培養(yǎng)基表面后密封，放入光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件同1.2.1，培養(yǎng)10 d，記錄各培養(yǎng)皿中菌落的數(shù)量。對(duì)于仍然有菌落出現(xiàn)的培養(yǎng)基，再重復(fù)上述操作，直至無(wú)菌為止；如果沒(méi)有菌落則無(wú)需接種。經(jīng)過(guò)上述除菌方法處理的鹽藻，再經(jīng)5次傳代培養(yǎng)（按1∶10的接種量培養(yǎng)于150 mL的三角瓶中，每代培養(yǎng)15 d），培養(yǎng)條件同1.2.1。培養(yǎng)期間，每日搖動(dòng)藻液3～5次，徹底消除殘留抗生素影響。最后，將藻液涂布在DM固體培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)10 d后，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 從運(yùn)城鹽湖藻樣中分離純化獲得一株杜氏鹽藻株系

將采自運(yùn)城鹽湖的藻樣經(jīng)連續(xù)平板稀釋法進(jìn)行分離純化，多次稀釋培養(yǎng)后，挑取生長(zhǎng)均勻的鹽藻單藻落，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征（圖1）。該藻細(xì)胞的顏色為黃綠色，單細(xì)胞呈橢圓形或梨形，有1對(duì)鞭毛，這是杜氏鹽藻的典型特征，表明試驗(yàn)已經(jīng)獲得1株杜氏鹽藻系（YC-011）。

2.2 6種抗生素對(duì)鹽藻藻液的除菌效果

本試驗(yàn)選擇卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、潮霉素和頭孢霉素6種抗生素進(jìn)行殺菌/抑菌試驗(yàn)，分別分析不同濃度抗生素對(duì)鹽藻藻液的除菌效果。鹽藻在含有0～400 μg/mL抗生素的固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)10 d后，共出現(xiàn)5種菌落，分別為紅色菌落、紫色菌落、淺黃色菌落、乳白色菌落和水泡狀菌落。

從表2可以看出，在6種抗生素中，卡那霉素、鏈霉素、潮霉素對(duì)鹽藻藻液的除菌效果較差，在400 μg/mL 濃度下，仍有菌落生長(zhǎng)；在 50 μg/mL 時(shí)菌落數(shù)量多于20個(gè)，故單獨(dú)除菌效果不太理想。頭孢霉素、氨芐青霉素和氯霉素單獨(dú)處理對(duì)鹽藻藻液的除菌效果明顯，且氯霉素除菌效果略好于氨芐青霉素和頭孢霉素。因此，頭孢霉素、氨芐青霉素和氯霉素可用作鹽藻除菌的抗生素。

表2 6種抗生素對(duì)鹽藻的除菌效果

2.3 杜氏鹽藻細(xì)胞對(duì)抗生素的耐受性

從圖2可以看出，鹽藻對(duì)氯霉素很敏感，低濃度下即可抑制其生長(zhǎng)，培養(yǎng)至第6天時(shí)，含有氯霉素200 μg/mL以上的鹽藻藻液顏色發(fā)黃，藻細(xì)胞分解，細(xì)胞內(nèi)容物流出。因此，必須選擇低濃度的氯霉素去除鹽藻藻液中的細(xì)菌。高濃度（800 μg/mL）頭孢霉素和氨芐青霉素也未完全抑制鹽藻細(xì)胞生長(zhǎng)（圖3，4）。因此，低濃度的氯霉素和高濃度的頭孢霉素或氨芐青霉素均可用于杜氏鹽藻除菌培養(yǎng)體系。

2.4 鹽藻培養(yǎng)液中細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性

取100 μL鹽藻藻液均勻涂布于2216E表面，將抗生素中浸泡過(guò)的紙片貼在培養(yǎng)基表面，通過(guò)計(jì)算抑菌圈的直徑（表3），進(jìn)而估算抗生素對(duì)細(xì)菌的抑制作用。6種抗生素對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用，但抑菌效果不同。每種抗生素能抑制藻液中某1種或2種類(lèi)型細(xì)菌的生長(zhǎng)?？敲顾匾志Ч^差，其他5種抗生素的抑菌效果較好（表3）。選用抑菌效果較好的前4種抗生素進(jìn)行后續(xù)的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。

表3 鹽藻培養(yǎng)液中細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性的測(cè)試

2.5 抗生素聯(lián)合抑菌的試驗(yàn)效果

選擇的4種抗生素（氯霉素、頭孢霉素、潮霉素和氨芐青霉素）兩兩組合后，顯著地抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，而且可以同時(shí)抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，說(shuō)明混合抑菌處理比單一抗生素的抑菌效果更好。氯霉素和氨芐青霉素組合處理時(shí)，抑菌圈最大；其次是氯霉素和頭孢霉素組合，其他組合抑菌效果都較好（表4）。因此，可以選擇這4種抗生素中的任意2種或2種以上進(jìn)行組合，進(jìn)而抑制藻液中細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而獲得杜氏鹽藻無(wú)菌柱。

表4 4種抗生素聯(lián)合抑菌的試驗(yàn)結(jié)果

2.6 氯霉素、氨芐青霉素和頭孢霉素對(duì)鹽藻藻液的多次除菌效果

從表 2 可以看出，50 μg/mL氯霉素、100 μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL頭孢霉素單獨(dú)處理鹽藻細(xì)胞時(shí)，藻內(nèi)雜菌數(shù)量已經(jīng)有了減少，說(shuō)明抗生素對(duì)其生長(zhǎng)有一定的抑制作用。但只處理1次時(shí)，菌落不能完全被抑制。因此，設(shè)計(jì)了氯霉素、氨芐青霉素和頭孢霉素的多次除菌試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)3次除菌處理后，固體培養(yǎng)基表面均無(wú)菌落出現(xiàn)。經(jīng)過(guò)上述除菌方法處理的鹽藻，再經(jīng)5次傳代培養(yǎng)，藻液中的殘留抗生素可以徹底消除。將培養(yǎng)后的藻液均勻涂布于DM固體培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)10 d后，培養(yǎng)基表面沒(méi)有菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明鹽藻培養(yǎng)液內(nèi)已無(wú)細(xì)菌存在。經(jīng)過(guò)以上試驗(yàn)處理，杜氏鹽藻的無(wú)菌培養(yǎng)體系已經(jīng)建立。

3 結(jié)論

本研究從運(yùn)城鹽湖藻樣中分離、純化、獲得1株杜氏鹽藻株系YC-011。該鹽藻細(xì)胞對(duì)氯霉素耐受性低，能抵抗一定濃度的頭孢霉素、氨芐青霉素。氯霉素、頭孢霉素和氨芐青霉素單獨(dú)處理對(duì)該株系鹽藻藻液的除菌效果明顯，然而，卡那霉素、鏈霉素和潮霉素單獨(dú)處理的除菌效果較差。抗生素組合處理抑菌效果更顯著。應(yīng)用50μg/mL氯霉素、100μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL頭孢霉素組合，對(duì)鹽藻藻液進(jìn)行3次除菌處理和5次繼代培養(yǎng)，獲得了純化的鹽藻細(xì)胞，即建立了杜氏鹽藻無(wú)菌培養(yǎng)體系。這為后續(xù)鹽藻商業(yè)化培養(yǎng)利用和該鹽藻株系多維生物學(xué)分析及鹽藻種質(zhì)的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

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