重金屬污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)探討

郜雅靜，李建華，靳東升，盧晉晶，郜春花，張 敏

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西 太原 030031）

隨著大量礦山的挖掘，工業(yè)廢氣、廢水、廢渣的亂排，農(nóng)業(yè)肥料的噴施，日常垃圾的堆棄等，將源源不斷的重金屬慢慢滲入土壤中，導(dǎo)致生物群落擾亂、土壤有機(jī)物質(zhì)減少、穩(wěn)定的土壤環(huán)境遭到了破壞，對人類生存發(fā)展造成了極大的威脅。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計，目前，我國遭受重金屬污染的耕地面積達(dá)到2 000萬hm2，這一狀況已經(jīng)超過全國耕地面積的1/6[1]。我國每年被重金屬污染的糧食多達(dá)1 200萬t，且因這種污染狀況每年減少的糧食產(chǎn)量也高出1 000萬t，合計財產(chǎn)損失超出200億元[2]。并且該形勢呈現(xiàn)逐漸增長趨勢。重金屬在土壤中很穩(wěn)定、難移動，不容易被水溶液溶解，且很難被微生物分解，沉積在土壤中難以去除，隨著在土壤—植物—動物中逐級累積，最終對人體健康造成極大危害。重金屬在土壤中的積累，不僅降低了土壤的生物量、生物種類和生物多樣性，同時又破壞了土壤結(jié)構(gòu)，擾亂了土壤生態(tài)系統(tǒng)，降低了土壤功能。

在重金屬污染土壤中存活很多微生物，這些微生物抵抗金屬能力強(qiáng)，且能夠利用自身的性質(zhì)改變金屬的形態(tài)，減輕金屬物質(zhì)對土壤的危害。使用微生物技術(shù)修復(fù)重金屬污染土壤成本低、速度快、實用性強(qiáng)，最終的產(chǎn)物都是穩(wěn)定、無毒、無害的物質(zhì)，對土壤環(huán)境友好，不會對土壤造成再次污染。因其具有無可比擬的修復(fù)優(yōu)勢，現(xiàn)已成為世界各國科學(xué)家改良和修復(fù)土壤污染的首要選擇。

1 微生物修復(fù)技術(shù)的國內(nèi)外研究動態(tài)

隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，重金屬污染呈現(xiàn)嚴(yán)峻的局勢，使得修復(fù)重金屬污染成為全世界都在關(guān)注的熱點課題。目前，國內(nèi)外大量專家針對在土壤中分布廣泛的一些細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物修復(fù)重金屬污染土壤方面做了許多有效的工作。

1.1 細(xì)菌修復(fù)重金屬污染

細(xì)菌作為微生物群體中最多的一類微生物，在修復(fù)重金屬污染土壤方面?zhèn)涫荜P(guān)注，其中，在細(xì)菌對重金屬的耐受性和吸附富集作用等方面的研究比較多。目前，已報道的能夠修復(fù)重金屬污染的細(xì)菌主要有：芽孢桿菌（Bacillus sp.），弗蘭克氏菌（Rhizobium Frank.），惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），鏈霉菌（Streptomyces），球菌（Micrococcus）等[3]，研究較多的是芽孢桿菌，其中，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、 蘇 云 金 芽 孢 桿 菌（Bacillus thuringiensis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus Meyer and Gottheil）、 地 衣 芽 孢 桿 菌（Bacillus licheniformis）等對重金屬均具有良好的耐受性和吸附性。劉紅娟等[4]試驗發(fā)現(xiàn)，蠟狀芽孢桿菌能夠在鎘濃度200 mg/L的瓊脂平板上快速生長，證明該菌株在抗鎘污染方面有著較強(qiáng)的優(yōu)勢；該菌株在液體培養(yǎng)基中 Cd2+，Cr3+，Pb2+濃度均為 75 mg/L 和 Mn2+濃度為100 mg/L培養(yǎng)時，菌株生長正常。曹德菊等[5]利用大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草桿菌（Bacillus subtili）、酵母菌（Saccharomyces sp.）等細(xì)菌對重金屬離子Cu，Cd進(jìn)行修復(fù)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，修復(fù)性能與重金屬含量呈正相關(guān)，土壤中Cu，Cd含量越低，微生物修復(fù)效果越好。

1.2 真菌修復(fù)重金屬污染

19世紀(jì)就發(fā)現(xiàn)了真菌可以吸附土壤中的重金屬離子，后來逐漸發(fā)現(xiàn)赤霉、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、絲狀真菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以及一些腐木真菌（Phellinusribis）對重金屬的抗性和吸附性[3]。隨后陸續(xù)在土壤中發(fā)現(xiàn)了越來越多的真菌具有耐受重金屬的能力，尤其是在重金屬污染嚴(yán)重的區(qū)域。很多報道發(fā)現(xiàn)，真菌對重金屬礦物耐受能力較強(qiáng)，在某些污染土壤中能夠選擇作為修復(fù)重金屬污染的優(yōu)勢種群。目前，側(cè)重于研究的真菌主要有青霉菌（Penicillium）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）等。陳燦等[6]通過表面顯微分析技術(shù)研究釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細(xì)胞吸附重金屬離子Pb2+前后的細(xì)胞表面變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pb2+和釀酒酵母相互作用后，溶液中Pb2+濃度極大減少，大部分吸附在釀酒酵母的細(xì)胞表面，一些在溶液中形成了沉淀物。BARGAGLI等[7]在大量汞礦附近發(fā)現(xiàn)，土壤中的菌根菌和腐殖質(zhì)分解菌能夠富集Hg，極大降低了汞的排放對環(huán)境的污染[7]。

1.3 放線菌修復(fù)重金屬污染

放線菌在土壤環(huán)境中分布廣泛、種類較多、適應(yīng)性強(qiáng)，一些研究發(fā)現(xiàn)，放線菌在修復(fù)重金屬土壤污染方面也占有重要的地位。NIES等[8]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，放線菌在新陳代謝過程中會釋放帶有絮凝活性的物質(zhì)，這些物質(zhì)分泌到細(xì)胞外能夠絡(luò)合重金屬形成沉淀物，引起金屬元素的價態(tài)變化，從而降低重金屬的生態(tài)毒性。AMOROSO等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬污染土壤中分布著許多抗性鏈霉菌，這些鏈霉菌不僅在重金屬土壤中有很強(qiáng)的耐受性，而且還可以通過自身作用溶解一些重金屬礦物；并對銅污染區(qū)的50株放線菌進(jìn)行了抗Cu2+研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些菌株對Cu2+的最大耐受濃度可達(dá)1 000 mg/L，經(jīng)過進(jìn)一步鑒定，這些抗性菌株為鏈霉菌屬。

2 重金屬污染土壤微生物修復(fù)機(jī)理

微生物修復(fù)重金屬污染土壤的機(jī)理，主要表現(xiàn)在4個方面：生物吸附和富集作用、氧化還原作用、溶解和沉淀作用以及菌根真菌作用等。

2.1 生物吸附和富集作用

微生物對重金屬離子的吸附作用主要是帶陽離子的金屬離子很容易與帶陰離子的微生物發(fā)生反應(yīng)，彼此作用聚集在微生物內(nèi)部或表面。微生物細(xì)胞一般分布有-NH2，-SH，-P043-等其他陰離子基團(tuán)，這些基團(tuán)通過離子交換、絡(luò)合等作用與金屬離子結(jié)合，從而達(dá)到對重金屬離子生物吸附的目的。微生物吸附在活細(xì)胞、死細(xì)胞中都可以作用，只是目前研究死細(xì)胞沒有很大的實用性，所以很多試驗偏向于研究在活細(xì)胞中微生物的吸附作用。重金屬吸附按照金屬離子與微生物細(xì)胞作用的部位不一樣又可分為3種類型：胞內(nèi)吸附、細(xì)胞表面吸附和胞外吸附。其中，胞內(nèi)吸附主要是微生物細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合蛋白、絡(luò)合素與重金屬離子結(jié)合，最后積聚在細(xì)胞內(nèi)；細(xì)胞表面吸附是與金屬離子結(jié)合的多肽、植物螯合素等展示到細(xì)胞表面，從而增強(qiáng)微生物吸附重金屬的能力；胞外吸附主要是利用微生物分泌到細(xì)胞外的蛋白質(zhì)、糖類、脂類及核素等物質(zhì)形成具有絡(luò)合重金屬離子作用的胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances），提高吸附效率。PULSAWAT等[11]研究發(fā)現(xiàn)，胞外聚合物可以快速吸附 Mg2+，Pb2+和 Cu2+，其中，對 Pb2+有很強(qiáng)的固定作用。如出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）能分泌胞外聚合物，將Pb2+積累在細(xì)胞表面，隨著分泌胞外聚合物的增加，細(xì)胞表面固定Pb2+的能力也不斷增強(qiáng)。也有很多報道指出，細(xì)菌與金屬離子的結(jié)合位點主要是肽聚糖、磷酸基等[12]。

微生物富集作用不同于吸附作用，它是一種主動運(yùn)輸過程，必須借助生物代謝活動持續(xù)供給能量才能完成，因此，在死細(xì)胞中不能發(fā)生，只能夠在活細(xì)胞中作用。另外，富集作用還需要油脂過氧化、載體蛋白和離子泵的輔助來完成。微生物富集作用與吸附作用機(jī)理一樣，都是由于帶陽離子的金屬易與帶陰離子的微生物發(fā)生反應(yīng)形成一定的作用。FOMINA等[4]使用掃描電鏡和X射線吸收譜技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在微生物富集作用中的含氧官能團(tuán)起到了重要作用。BEVERIDGE等[13]分離出芽孢桿菌（Bacillus）的細(xì)胞壁后，將其放進(jìn)溶液中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁絡(luò)合了大量的金屬元素，接著又通過研究改變?nèi)芤褐械娜苜|(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶質(zhì)為氯化物時，細(xì)胞壁絡(luò)合金屬能力最強(qiáng)。微生物對重金屬的吸附和富集作用主要受微生物多樣性、影響微生物生長的外界環(huán)境條件（土壤酸堿性、溫度、有機(jī)物）以及重金屬的類型、濃度、毒性等多種因素的影響。

2.2 氧化還原作用

氧化還原作用主要是多價的金屬離子在微生物氧化還原作用下價態(tài)發(fā)生變化，重金屬離子的活性和毒性降低，從而達(dá)到治理污染的目的。例如被列為重金屬污染“五毒”之一的Cr元素，在土壤中Cr處于高價Cr6+時，其毒性和水溶性很強(qiáng)；當(dāng)處于低價Cr3+時，在土壤中移動性較差，其毒性和水溶性也很低。土壤中生存著大量能夠使含鉻無機(jī)鹽還原的微生物，如產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes Castellani）、芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter Hormaeche and Edwards）、假單胞菌屬（Pseudomonadaceae）和微球菌屬（Micrococcaceae Pribram）等菌通過還原作用，把高活性的Cr6+還原成低活性的Cr3+，減小了Cr隨水溶解的能力和對土壤的污染[14]。

生物氧化還原反應(yīng)可以根據(jù)金屬離子在微生物代謝過程中是否起直接作用，又分為同化（Assimilatory）氧化還原反應(yīng)和異化（Dissimilatory）氧化還原反應(yīng)[15]。其中，同化氧化還原反應(yīng)是金屬離子直接通過電子受體參與微生物的新陳代謝活動；異化氧化還原反應(yīng)則是金屬離子在生物代謝過程中沒有利用電子受體直接作用，而是間接參與了氧化還原反應(yīng)。另外，有些土壤微生物在新陳代謝過程中也會通過分泌氧化還原酶，加速微生物氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行，從而促進(jìn)金屬離子溶解[16]。用微生物氧化還原作用去除重金屬汞離子的污染研究較多，土壤中分布著多種細(xì)菌，可以在汞還原酶的作用下將高價Hg2+還原為低價汞（0），非活性的汞（0）通過揮發(fā)作用降低了在土壤中的含量；另外，Hg2+也可以通過異化還原細(xì)菌在電子供體的條件下還原成汞（0），以實現(xiàn)汞污染土壤生物修復(fù)的目的。

2.3 沉淀和溶解作用

生物沉淀主要是微生物在新陳代謝過程中能夠分泌多種物質(zhì)與金屬反應(yīng)形成沉淀，它是一種新興的技術(shù)。根據(jù)代謝產(chǎn)物的多樣性，沉淀作用分為多種形式：第一，金屬離子可以通過代謝產(chǎn)物無機(jī)鹽與金屬離子反應(yīng)形成沉淀，這類機(jī)制一般固定Cu，Pb等重金屬元素。MCGOWEN等[17]研究發(fā)現(xiàn)，P能夠降低Cd，Pb和Zn的溶解，而使用石灰能夠提高土壤的酸堿度，固定更多的Cr3+，降低Cr在土壤中的遷移性。第二，當(dāng)微生物代謝產(chǎn)物是氫氧化物時，同樣會與金屬離子反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，這一作用還會使基質(zhì)表面化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化。LU等[18]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為4.0時，Pb2+與Fe（OH）3極易形成沉淀，效果是同等條件下吸附作用的好幾倍。第三，微生物的代謝產(chǎn)物S2-，PO42-也能夠與金屬離子發(fā)生作用，使活性的金屬離子形成沉淀。VANROY等[19]研究證明，硫酸鹽還原細(xì)菌生長過程中釋放的代謝產(chǎn)物能夠?qū)⒘蛩猁}還原成硫化物，與遷移能力強(qiáng)的重金屬離子反應(yīng)生成沉淀，減小污染物對土壤的危害。

微生物溶解作用也是利用微生物代謝過程中分泌出來的酸類物質(zhì)，與金屬離子發(fā)生反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)最早的是真菌可以利用代謝活動中釋放小分子量的有機(jī)酸、氨基酸等酸類物質(zhì)溶解重金屬礦物。另外，微生物也可以利用土壤環(huán)境中有效的養(yǎng)分和能量，促進(jìn)微生物的代謝過程釋放更多的有機(jī)酸，加速土壤重金屬的溶解作用[20]，減小金屬對土壤的毒害作用。張溪等[14]通過設(shè)置不同含碳量條件下，微生物使用土壤中有效的營養(yǎng)物質(zhì)和能源進(jìn)行代謝反應(yīng)分泌有機(jī)酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定條件下含碳量越高，微生物分泌的有機(jī)酸含量越多，溶解的重金屬也越多。

2.4 菌根真菌生物有效性作用

菌根真菌作用是在某些植物根部分布的一些真菌微生物通過代謝活動分泌有機(jī)酸，進(jìn)而活化重金屬離子，同時還可以通過離子交換、分泌激素等作用影響植物對重金屬的吸收。THOMPSOM[21]通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，在撂荒地的土壤上通過接種叢枝菌根（Vesicalar-Arbuscular），能夠增強(qiáng)亞麻對磷、鋅等重金屬的吸收。菌根真菌與植物是一種互利共生的系統(tǒng)，二者相互作用能夠有效降低重金屬污染，其作用表現(xiàn)在3個方面：第一，自然界存在大量可以富集重金屬的植物，能夠絡(luò)合活性強(qiáng)、毒性高的金屬離子，同時植物根系還可以釋放大量的代謝物質(zhì)，為微生物代謝活動供應(yīng)必需的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，提高微生物在土壤中的活性；另外，代謝活動分泌的大量有機(jī)物也可以絡(luò)合重金屬元素，形成更多的沉淀物。第二，微生物代謝活動過程中分泌的有機(jī)物可以促進(jìn)微生物與重金屬的氧化還原和溶解作用的發(fā)生，降低金屬礦物在土壤中的危害。第三，菌根真菌與植物互生關(guān)系同時可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育，尤其是在貧瘠的環(huán)境中，菌根菌利用龐大的菌絲構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以為植物根系供給必要的水分、營養(yǎng)礦物和一些植物必需的微量元素等[22]。

3 微生物修復(fù)技術(shù)的優(yōu)點和局限性

微生物修復(fù)技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢：微生物個體微小，肉眼難見，比表面積大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜，自然界分布廣，土壤中資源豐富，可以快速處理金屬污染問題，同時處理多種重金屬的混合污染；修復(fù)重金屬能力強(qiáng)，不會對土壤形成再次污染，對土壤結(jié)構(gòu)、土壤功能和微生物生態(tài)環(huán)境影響??；微生物繁殖較快，代謝能力強(qiáng)，修復(fù)費(fèi)用少，與植物聯(lián)合修復(fù)成為目前修復(fù)重金屬污染的重點研究方向。各種優(yōu)勢使得微生物在修復(fù)土壤過程中占有獨(dú)特的地位。

從當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用微生物修復(fù)重金屬污染是最具使用價值的一項技術(shù)，然而，由于微生物本身的性質(zhì)，其在使用過程中存在局限性。首先，遺傳穩(wěn)定性差、易變化，難以去除所有污染物等；其次，微生物對重金屬離子的吸附和富集能力是一定的，并且與土著微生物菌株存在生存競爭關(guān)系，最終這些微生物可能因競爭失利而被淘汰；最后，微生物修復(fù)容易受到外界環(huán)境溫度、pH等其他因素的影響，從而影響修復(fù)效果。因此，在大田應(yīng)用前必須通過田間試驗反復(fù)驗證，確保修復(fù)地區(qū)能夠適應(yīng)微生物生長，這一條件極大限制了微生物修復(fù)技術(shù)在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

4 展望

重金屬污染土壤不僅擾亂土壤生態(tài)環(huán)境，而且也嚴(yán)重影響人類的生活和社會的發(fā)展。因此，快速解決污染土壤問題成為目前刻不容緩的議題。由于利用微生物技術(shù)修復(fù)具有多重優(yōu)勢，因而被越來越廣泛地應(yīng)用，今后研究的重點主要是以下幾個方面。

4.1 特種微生物菌種的篩選

除了針對特定微生物的篩選，還需要篩選一些能在特定環(huán)境下生長的微生物，例如耐鹽堿化、耐干旱、耐高溫、耐低溫等類型的微生物。同時，能夠應(yīng)用相關(guān)的分子生物學(xué)方法構(gòu)建“超級工程菌”，選取去除重金屬能力強(qiáng)、修復(fù)時間短的菌種使用在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，提高修復(fù)重金屬污染土壤的效率。此外，有必要進(jìn)一步研究修復(fù)微生物與土著微生物之間的關(guān)系，為多菌株的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

4.2 微生物修復(fù)機(jī)理的進(jìn)一步研究

利用微生物修復(fù)重金屬污染土壤是一個極其復(fù)雜的過程，不僅涉及微生物的分子作用，還包括微生物與金屬發(fā)生物理、化學(xué)等反應(yīng)。其中，修復(fù)機(jī)理也是多樣化，包括生物吸附、富集、氧化還原、溶解沉淀、菌根真菌等多種作用。為了將來更高效地達(dá)到修復(fù)目的，需要更深程度研究微生物的修復(fù)機(jī)理，從分子領(lǐng)域更好地解釋機(jī)理的發(fā)生，并利用掃描、紅外分析等技術(shù)的分析修復(fù)效果，更好地為實際工程應(yīng)用提供理論支持。

4.3 優(yōu)化組合修復(fù)技術(shù)的建立

優(yōu)化多種組合修復(fù)技術(shù)，構(gòu)建如動物—微生物、植物—微生物、動物—植物—微生物、物化方法—微生物等組合，結(jié)合每一種修復(fù)方法的優(yōu)勢，更有效更快速解決各種重金屬污染問題。多種方法組合修復(fù)技術(shù)的建立，將是未來修復(fù)重金屬污染的首要選擇。其中，運(yùn)用植物—微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染，成本低，對環(huán)境友好，效率高，且可利用性強(qiáng)，因此，必將成為今后研究多種組合修復(fù)重金屬污染的核心。

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