利用花粉介導法獲得油菜RNAi轉(zhuǎn)基因植株

王曉敏，王耀輝，耿思宇，咸栓獅，杜春芳，王景雪

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，山西 運城 044000）

油菜是一種重要的油料經(jīng)濟作物，其產(chǎn)量及質(zhì)量對其經(jīng)濟價值有著非常重要的影響。油菜不僅是食用植物油的最主要來源，也是潛在的僅次于豆粕的大宗飼用蛋白源，而且還是目前用于解決全球能源危機方向之一的生物柴油的理想原料[1]。目前，油菜的遺傳轉(zhuǎn)化研究體系已日趨成熟，用于轉(zhuǎn)化的目的基因也更加多樣化，通過將不同優(yōu)良基因轉(zhuǎn)入油菜，獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而提高油菜的產(chǎn)量、抗性，改善油菜的品質(zhì)。吳珣[2]研究表明，將BnSDIR1和BnRab7基因轉(zhuǎn)入甘藍型油菜提高了植株抗旱、耐鹽的能力。BONDARUK等[3]研究表明，將ACP基因轉(zhuǎn)入甘藍型油菜，提高了油菜種子中不飽和脂肪和硬脂酸的含量。WANG等[4]研究表明，在甘藍型油菜中導入LRP基因，提高了油菜種子中賴氨酸的含量。LIU等[5]研究表明，將孢子囊和幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗筒酥?，得到的轉(zhuǎn)基因油菜具有很強的抗小菜蛾和核盤菌的能力。ZHU等[6]研究表明，在油菜中轉(zhuǎn)入ThIPK2基因，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強的抗鹽、抗干旱、抗氧化等非生物逆境的能力。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是一種經(jīng)過雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)的、過程非常保守的、可以導致同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象。RNAi是生物體的一種保護自我的現(xiàn)象，具有重要的生理意義[7]：首先它能夠通過降解mRNA來抑制病菌復制[8]；其次還能夠阻止轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，保證細胞基因組和功能的完整性[9]；同時，RNAi還可以使基因沉默，而且是隨機的。所以，只要提供與目的基因相對應的dsRNA，就能夠達到預想的目的，比基因敲除技術(shù)更為方便、快捷。

HKL1是一種己糖激酶類似物，沒有催化己糖磷酸化的活性，但在植株的生長發(fā)育過程中具有重要作用。HEAZLEWOOD等[10]研究認為，HXK1和HKL1主要位于線粒體上，是植物呼吸過程中必不可少的酶之一。OBAYASHI等[11]研究表明，多種激素與HKL1基因的表達密切相關(guān)。己糖激酶（HXK）在植物的生長發(fā)育過程中是必不可少的[12]。

杜春芳等[13]的研究主要是對轉(zhuǎn)化方法的研究，杜建中等[14]雖然對轉(zhuǎn)入基因的功能進行了研究，但是也僅限于表型的觀察等，更深層次的研究較少。

本試驗是第1次采用花粉介導法將RNAi型質(zhì)粒轉(zhuǎn)入甘藍型油菜中，并對其基因的表達量等也進行了相應的研究，且外源基因在各代中都穩(wěn)定遺傳?；ǚ劢閷Хㄝ^農(nóng)桿菌侵染法、PEG法等省去了繁瑣的無菌苗組織培養(yǎng)過程，操作更為簡單，成本低，實用性更強。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗以甘藍型油菜品種7B為受體材料，其由山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所油菜課題組提供。外源基因為攜帶有目的基因HKL1的pCaMHKL1-RNAi質(zhì)粒，質(zhì)粒線性圖譜如圖1所示。該質(zhì)粒中含有GUS標記基因，可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)基因檢測，受35S啟動子（CaMV35S）調(diào)控。HIndIII和 Xbal為酶切位點。NPTII為新氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因，是卡那霉素篩選標記。

1.2 試驗方法

1.2.1 質(zhì)粒DNA的提取 將RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，于LB培養(yǎng)基（Kan 100 mg/L）37℃，180 r/min進行擴大培養(yǎng)后，采用堿裂解法[15]從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA，溶于TE溶液，備用。

1.2.2 植物轉(zhuǎn)化 采用花粉介導法[16]進行RNAi質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。供試材料甘藍型油菜品種7B種植于山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所試驗地內(nèi)，2015年4月初開花。在開花期進行基因轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前將即將開花的主莖或1次分支上的花蕾去雄，第2天上午取當天開花的花粉，置于0.25 mol/L蔗糖溶液中，加入質(zhì)粒，進行超聲波處理。然后，將處理過的花粉授于去雄的雌花柱頭上，套袋并標記，同時記錄授粉花蕾數(shù)。5～6 d后去袋。于當年5月收獲種子。

1.2.3 植物DNA提取及PCR轉(zhuǎn)基因鑒定 2015年11月將收獲的T0種子播種于溫室進行生長。觀察幼苗在生長過程中的表型變化，并拍照記錄。當植株長出5～6片真葉時，采用CTAB法提取植物的總DNA。由于RNAi質(zhì)粒攜帶有GUS標記基因，利用Primer 5.0軟件設(shè)計GUS基因的上下游引物分別為5′-GTGAATCCGCACCTCTGG-3′和 5′-ATCGCCGC TTTGGACATA-3′。PCR擴增條件為：預變性94℃，3 min；變性 94 ℃，30 s；退火 56 ℃，30 s；延伸 72℃，1 min；終延伸72℃，7 min；30個循環(huán)。反應結(jié)束后，配置1%的瓊脂糖凝膠，進行電泳分析，統(tǒng)計PCR結(jié)果。2016年7月將收獲的部分T2種子先播種于小花盆，置于4℃，16 h光照、8 h黑暗的生化培養(yǎng)中進行春化處理，后再將其移入溫室進行生長。

1.2.4 qRT-PCR檢測基因的表達量 qRT-PCR用于檢測T2轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物中HKL1基因的相對表達量。用Trizol（TaKaRa）從樣品中提取植物總RNA，凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。通過PrimeScript RT gDNA Eraser（TaKaRa） 試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑進行qRT-PCR試驗，將油菜Actin基因的相對擴增作為內(nèi)部對照。利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計HXK1L和Actin基因的上下游引物HXK1L：5′-TGAAGAAGCAACGAGAAGAGC-3′；5′-ATAGGCAGAGATGGAAGCGGA-3′，Actin：5′-CCCT GGAATTGCTGACCGTA-3′；5′-TGGAAAGTGCTGC TGAGGGATGC。qRT-PCR反應程序為：95℃，15min；95 ℃，10 s；57 ℃，15 s；60 ℃，10 s；72 ℃，20 s；40 個循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用ABI 7500 SDS軟件（Applied Biosystems）分析qRT-PCR數(shù)據(jù)，并用比較Ct法（2-ΔΔCt）處理數(shù)據(jù)[17]。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析使用SPSS20.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉介導法獲得擬RNAi植株

2015年4月利用花粉介導法進行外源基因轉(zhuǎn)化，于當年5月收獲種子，結(jié)實率統(tǒng)計如表1所示，T0植株中，去雄總數(shù)295個，結(jié)果莢數(shù)63個，結(jié)果莢率為21.36%，收獲種子總數(shù)為221粒。

表1 轉(zhuǎn)基因處理后植株結(jié)實情況

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

2015年11月從中選取129粒種子播種于溫室，待植物長出5～6片真葉時，提取其基因組DNA（圖2），通過PCR擴增檢測樣品中的GUS標記基因，進行轉(zhuǎn)基因植株鑒定（圖3）。結(jié)果表明，播種的129粒T1油菜種子，生長過程死亡9棵，剩余的120棵油菜植株中42棵為轉(zhuǎn)基因植物，其中，38棵植株收獲T2種子。T2種子在2016年7春化處理后種植于溫室，PCR擴增進行轉(zhuǎn)基因植株鑒定。轉(zhuǎn)基因植物中GUS基因的分離比如表2所示。從表2可以看出，轉(zhuǎn)基因植物株系BT2-1，BT2-10和BT2-11中顯示出預期的3∶1（轉(zhuǎn)基因∶非轉(zhuǎn)基因植物）的GUS基因的分離比，意味著這些T2轉(zhuǎn)基因株系是雜合子。而在植株株系BT2-9和BT2-12中的T2轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為GUS陽性，意味著這些T2轉(zhuǎn)基因株系是純合子。

表2 T2轉(zhuǎn)基因油菜植株中GUS基因的分離

2.3 QRT-PCR測定HKL1基因的相對表達量

提取轉(zhuǎn)基因植株的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行qRT-PCR試驗，利用qRT-PCR試驗測定了部分RNAi植株和野生型植株中HKL1基因的相對表達量（圖4），結(jié)果表明，RNAi植株中HKL1基因的相對表達量為野生型植株的24.6%～67.9%，不同RNAi植株中HKL1基因的表達量各不相同，基因表達量不同是因為其插入位點不同。

2.4 RNAi植株在生長發(fā)育過程的表型變化

在T2植株的生長過程中，觀察到與野生型植株相比，RNAi型轉(zhuǎn)基因植株真葉長出的時間較晚（圖5-A，B），株型也較小（圖5-C）。RNA干擾油菜植株中的HKL1基因的表達，會影響植株的生長發(fā)育。KARVE等[18]研究表明，在擬南芥中，HKL1負調(diào)控植株的生長發(fā)育。

3 討論

本試驗采用花粉介導法進行外源基因轉(zhuǎn)化，相比較于農(nóng)桿菌侵染、PEG等轉(zhuǎn)化方法省去了繁瑣的組織培養(yǎng)過程，操作方便、成本低、實用性強。但是花粉介導法也有其局限性：只有在植物開花期才能采取該方法，有一定的時間局限性；需要人工去雄，將含苞的花蕾剝開摘取雄蕊（這一過程要小心，避免破壞花蕾，影響后期的轉(zhuǎn)化效率）；需要超聲波輔助將質(zhì)粒DNA導入花藥細胞中，超聲時間、功率、次數(shù)和每次超聲的間隔時間等都會對質(zhì)粒DNA導入花藥細胞和花粉的活力產(chǎn)生較大的影響，而且不同植物的花粉量和花藥的活力等不盡相同，要根據(jù)具體的試驗材料確定其合適的超聲參數(shù)。所以，利用花粉介導法進行基因轉(zhuǎn)化時，要選擇合適的轉(zhuǎn)化條件，提高外源基因的轉(zhuǎn)化率。

本試驗是第1次利用花粉介導法將一個RNAi型質(zhì)粒轉(zhuǎn)入甘藍型油菜中，旨在探究用花粉介導法轉(zhuǎn)化RNAi型質(zhì)粒的效率，并簡要研究HKL1基因?qū)τ筒酥仓晟L和發(fā)育的影響。結(jié)果表明，利用花粉介導法可以成功地進行RNAi型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，而且目的基因可以在后代植株中穩(wěn)定遺傳，其基因分離也符合基本的孟德爾定律。

目前，對己糖激酶（HXK）在植物中的相關(guān)研究主要集中在少數(shù)模式植物上（如擬南芥、煙草等），TAO等[19]以甘薯為試驗材料，研究了其不同組織中HXK的表達量，結(jié)果表明，HXK的表達量在甘薯的初始膨大塊根中最高，在成熟葉片中最低。KARVE等[20]研究認為，己糖激酶在植物中經(jīng)常以多基因家族的方式出現(xiàn)。H?USLER等[21]研究發(fā)現(xiàn)，植物中HXKs可以把葉綠體生成的糖信號傳導到細胞核中，調(diào)節(jié)光合反應中有關(guān)基因的表達。KELLY等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥和番茄中過表達HXK1，能夠降低擬南芥氣孔導度和蒸騰作用。

在甘藍型油菜中HXKs的研究尚未報道，對油菜中HXK基因表達的時空變化、對非生物脅迫的響應以及在油菜中的作用仍不清楚。所以，研究甘藍型油菜中的HXK及其功能是有必要的。本試驗結(jié)果可以為HXKs在植物中的表達情況及其相關(guān)的功能研究提供一些理論依據(jù)，以完善HXKs在植物方面的相關(guān)研究。

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