糜子特異性SSR標記的開發(fā)

王璐琳 ，王瑞云 ，，何杰麗 ，薛延桃 ，陳 凌 ，王海崗 ，喬治軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西 太谷 030801）

糜子（Panicum miliaceum L.），又叫黍稷，為禾本科黍?qū)?，是我國古老作物之一，在小雜糧作物中占有重要地位，栽培歷史悠久[1-2]，具有抗鹽抗旱等優(yōu)良特性[3-4]，由于糜子對各種土壤都有極好的適應(yīng)能力，所以，在我國北方干旱半干旱地區(qū)具有很大的生產(chǎn)優(yōu)勢[5-8]。近年來，隨著對小雜糧研究的逐漸深入，糜子的保健功能逐漸被世人認可[9]。不管是對糜子的表觀研究還是分子水平的研究，都已成為人們的研究熱點。連帥等[10]利用SSR分子標記對國內(nèi)外糜子地方品種和野生資源的遺傳多樣性進行了研究；王瑞云等[11]利用熒光SSR對我國糜子的遺傳多樣性進行了分析。近幾年，農(nóng)業(yè)部將糜子列入了產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系，這對于糜子新品種選育、高產(chǎn)栽培技術(shù)研究、種質(zhì)資源的鑒定和優(yōu)異基因挖掘都具有很好的促進作用。加速開展分子生物學(xué)技術(shù)在糜子這一作物上的研究應(yīng)用，對于提高糜子整體研究水平具有重要意義。

SSR標記在分子標記中的應(yīng)用較為廣泛，其原理是：在所有的真核生物基因組中，都存在一類由1～6個堿基序列串聯(lián)而成的DNA堿基序列，由于等位基因不同而重復(fù)數(shù)不同，可根據(jù)重復(fù)序列兩側(cè)保守序列設(shè)計特異性引物，之后進行PCR擴增，這種微衛(wèi)星標記序列是由保守序列決定，且有染色體位點的特異性，因此，大多數(shù)真核生物的遺傳標記來源于此。SSR分子標記技術(shù)擁有高度多態(tài)信息含量（PIC）豐富的分子標記[12]，即簡單重復(fù)序列，長度一般較短，廣泛的分布在基因組不同的位置[13]。SSR分子標記的共顯性好、多態(tài)性豐富，因而，成為糜子最實用的檢測標記技術(shù)。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)實驗室前期轉(zhuǎn)錄組測序獲得了70個三堿基重復(fù)微衛(wèi)星標記，本試驗基于這些標記設(shè)計引物，對來源不同的糜子品種的基因組DNA進行擴增，篩選具有多態(tài)性的引物，為糜子資源的遺傳差異提供分子檢測工具。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究選取來自不同生態(tài)區(qū)的6份糜子材料（表1），種植于營養(yǎng)缽中，于三葉期剪取新鮮葉片，提取基因組DNA。

表1 6個耐鹽性篩選黍子品種的名稱、編號、生態(tài)栽培區(qū)及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 SSR引物的設(shè)計與合成 利用primer5.0設(shè)計引物，設(shè)計時遵循A堿基不能在3′端出現(xiàn)，上下游引物的退火溫度之間相差不要太大（表2）。

表2 引物設(shè)計參數(shù)

1.2.2 基因組DNA的提取與檢測 采用改良后的CTAB法提取糜子全基因組DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳以及紫外微量核酸儀來檢測DNA的質(zhì)量、純度和濃度，最后稀釋成10倍備用。

1.2.3 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系（20 μL）：ddH2O 13.8 μL，dNTPs 1.6 μL，Taq 聚合酶 0.4 μL，前后引物各 0.6 μL，10×buffer 2.0 μL，DNA 模板 1.0 μL。PCR擴增程序為：預(yù)變性94℃5 min；變性94℃45 s，退火 50 s，延伸 72 ℃ 1 min，共 38 個循環(huán)；后延伸72℃10 min。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳 將SSR PCR擴增的產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，電泳緩沖液10×TBE，電壓 200 V，時間 2.5 h，用 AgNO3進行染色，在LED燈光工作臺上進行觀察并讀取特異性條帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)電泳結(jié)果中有無擴增的條帶，有記錄記為1，沒有記為0，以此方法來記錄不同糜子品種在同一引物中的等位點基因的變異情況，然后利用power marker V3.25軟件計算各引物的多態(tài)性信息含量（PIC），利用Rp＝∑Ib，Ib＝1-（2×|0.5-P|）公式計算引物分辨率（Resolving power，Rp）。其中，Ib表示某個等位基因信息量；P表示某個等位基因在6份材料中出現(xiàn)的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 70對SSR引物的多態(tài)性篩選

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，70對SSR引物中有67對引物可以擴增出條帶（圖 1，2），3對引物無擴增結(jié)果（圖 3）。67對有擴增片段的引物中，17對DNA條帶呈多態(tài)性（圖 2），50對為單態(tài)（圖 1）。

2.2 17對SSR引物的遺傳參數(shù)分析

從表3可以看出，17個位點共檢測到47個等位變異；每個位點等位變異數(shù)為2～4個，平均為2.8個。其中，RYW87 最高，RYW82，RYW92，RYW97，RYW102最低。

17個位點的多態(tài)性信息含量（PIC）為0.239 2～0.6713，平均為 0.4321，其中，RYW87 最高，RYW89，RYW92，RYW97，RYW102最低。就PIC值而言，6個位點（RYW86，RYW87，RYW88，RYW91，RYW99，RYW101）大于0.5，為高度多態(tài)性位點；7個位點（RYW90，RYW93，RYW94，RYW95，RYW96，RYW98，RYW100）為0.25～0.5，為中度多態(tài)性位點；4個位點（RYW89，RYW92，RYW97，RYW102）小于 0.25，為低度多態(tài)性位點。

17個位點的基因多樣性指數(shù)為0.2778～0.7223，平均為0.4902；其中，RYW87最大，RYW89，RYW92，RYW97，RYW102最小。17個SSR的片段大小為175～375 bp，最大為 RYW86，最小為 RYW98。

表3 6個SSR標記的遺傳參數(shù)

2.3 17對引物的特征參數(shù)

表4 17對引物的特征參數(shù)

17對多態(tài)性引物的分辨率如表4所示。結(jié)果 表明，SSR標記的分辨率介于0.333 3～2.333 3，其中，RYW87最高，RYW91，RYW102最低。從圖 4可以看出，SSR標記在0～1之間的分布頻率為41%，1～2，2～3的分布頻率分別為53%和6%。

3 討論

近年來，隨著科研技術(shù)的日漸發(fā)達，分子生物學(xué)在各個行業(yè)不斷興起，我國自古以來就是一個農(nóng)業(yè)大國，擁有比較豐富的作物品種資源，豐富的作物品種資源促進了重要基因庫遺傳改良的建立，奠定了培育優(yōu)良、高產(chǎn)新品種的堅實物質(zhì)基礎(chǔ)，大大減少了育種家的工作強度，因此，必須深入了解作物的遺傳背景和親緣關(guān)系等，有效利用這些豐富的種質(zhì)資源，為日后育種及品種遺傳基礎(chǔ)的多樣性提供保障。

目前，人們通過形態(tài)學(xué)標記、細胞學(xué)標記、生化標記或DNA分子標記來對物種的遺傳多樣性進行研究，前3種比較容易受到環(huán)境、植物生長發(fā)育和人為因素的影響，所以，結(jié)果不太準確。而DNA分子標記中，常用的方法有RELP，RAPD，AFLP，SSR和SNP等。其中，SSR以其基因組的豐富度高，遺傳表現(xiàn)為共顯性，同時對DNA質(zhì)量要求較低，但其重復(fù)性以及多態(tài)性水平較高，而且隨著近幾年高通量測序技術(shù)的發(fā)展，成本也較低，受到人們的青睞。

HU等[14]首先利用其他物種的SSR標記對我國的糜子進行遺傳多樣性研究，由于SSR引物的種間差異使得其通用性較低，因此，想要準確對糜子資源進行更為深入的研究，急需開發(fā)來自糜子基因組的特異性SSR標記。CHO等[15]通過構(gòu)建糜子基因組的基因文庫，成功開發(fā)了25個SSR標記，并在此基礎(chǔ)上，HUNT 等[16]、董俊麗等[2]、王瑞云等[11]、連帥等[17]和劉笑瑜等[18]利用上述SSR分子標記評估國外和我國的糜子資源。董俊麗等[2]選用19個SSR標記對來自俄羅斯和中國的96份糜子資源進行分析，結(jié)果表明，基因多樣性指數(shù)和PIC值分別為0.409 7和0.392 0；同時對這些資源進行了遺傳結(jié)構(gòu)和聚類分析，結(jié)果表明，聚類分析將資源分為3個類群，且2種方法有一定程度的類似，分布與環(huán)境有密切的關(guān)系。連帥等[17]選用5對SSR引物對5個糜子生態(tài)區(qū)的40個糜子資源進行多樣性分析，共檢測出15個等位點基因，平均為3個，遺傳多樣性指數(shù)和PIC值分別為0.76和0.48。劉笑瑜等[18]選用6對SSR引物對來自我國不同省份的40份糜子資源進行遺傳多樣性研究，共發(fā)現(xiàn)20個等位點變異，其中，平均遺傳多樣性指數(shù)和PIC值分別為0.542 6，0.3403。王瑞云等[10]利用15對糜子熒光特性SSR標記對來自我國的132份糜子資源進行遺傳多樣性分析，共檢測到107個等位點變異，幅度在2～14個，平均為7個，基因多樣性指數(shù)平均為0.529 8，PIC值平均為0.486 4，高于本次試驗（0.425 6），其聚類和遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)果相似與試材的地理起源有密切的關(guān)系。然而這些試材中的PIC值普遍較低且不足的是SSR標記還是較少，對于豐富的糜子資源很難全面準確地進行遺傳多樣性分析，所以，開發(fā)大量來自本物種基因組DNA的SSR標記的需求是極其迫切的，但是礙于當(dāng)時技術(shù)水平有限，無法快速開發(fā)出大量SSR分子標記。王瑞云等[19]運用該高基元分子檢測系統(tǒng)評估我國糜子資源的遺傳差異，結(jié)果表明，聚類群組與地理起源相關(guān)，其中，北方春糜子區(qū)和黃土高原春夏糜子區(qū)遺傳多樣性最豐富。

SSR分子標記已經(jīng)在在大豆[20]和棉花[21]等經(jīng)濟作物上廣泛應(yīng)用。本試驗通過利用6個不同省份的糜子對70對SSR引物進行多樣性篩選，共篩選出17對具有多態(tài)性的引物，后續(xù)試驗將利用這17條引物對更多糜子基因型進行遺傳多樣性分析，為糜子分子標記輔助育種提供檢測工具。

［1］WANG R Y，HUNT H V，QIAO Z J，et al.Diversity and cultivation of broomcorn millet（Panicum miliaceum L.）in China:A Review[J].Economic Botany，2016，7（3）：1-11.

［2］董俊麗，王海崗，陳凌，等.糜子骨干種質(zhì)遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（16）：3121-3131.

［3］Wang R Y，Wang H G，Liu X Y，et al.Drought-induced transcription of resistant and sensitive common millet varieties[J].The Journal of Animal&Plant Sciences，2017，27（4）：1303-1314.

［4］郭琦.中國糜子（Panicum miliaceum L.）種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［5］王綸，王星玉，溫琪汾，等.中國黍稷種質(zhì)資源研究與利用[J].植物遺傳資源學(xué)報，2005，6（4）：474-477.

［6］王綸，王星玉，溫琪汾，等.中國黍稷種質(zhì)資源蛋白質(zhì)和脂肪含量的鑒定分析[J].中國遺傳資源學(xué)報，2007，8（2）：165-169.

［7］張盼盼，馮佰利，王鵬科，等.干旱條件下糜子葉片衰老與保護酶活性的變化[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2010，28（2）：99-108.

［8］劉敏軒，張宗文，陸平，等.黍稷種質(zhì)資源芽、苗期耐中性混合鹽脅迫評價與耐鹽生理機制研究 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（18）：3733-3743.

［9］PARK M Y，JANG H H，KIMJ B，et al.Hog millet（Panicum miliaceum L.）-supplemented diet ameliorates hyperlipidemia and hepatic lipid accumuion in C57BL/6J-ob/obmice[J].Nutr Res Pract，2011（5）：511-519.

［10］連帥，陸平，喬志鈞，等.利用SSR分子標記研究國內(nèi)外黍稷地方品種和野生資源的遺傳多樣性 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49（17）：3264-3275.

［11］王瑞云，季煦，陸平，等.利用熒光SSR分析中國糜子遺傳多樣性[J].作物學(xué)報，2017，43（4）：530-548.

［12］季煦，王瑞云，曳水瑛，等.基于SSR的中國糜子遺傳多樣性分析 [J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版），2015，35（2）：137-142.

［13］朱彩梅，張京.應(yīng)用SSR標記分析中國糯大麥種質(zhì)的遺傳多樣性[J].植物遺傳資源學(xué)報，2010，11（1）：57-64.

［14］HU X Y，WANG J F，LU P，et al.Assessment of genetic diversity in broom-corn millet（Panicum miliaceum L.）using SSR markers[J].Journal of Genetics and Genomics，2009，36：491-500.

［15］ CHO R J，MINDRINOS M，RICHARDS D R，et al.Genome wide mapping with biallelic markers in Arabidopsis thaliana[J].Nature Genetics，1999，23：203-207.

［16］HUNT H V，CAMPANA M G，LAWES M C，et al.Genetic diversity and phylogeography of broomcorn millet（Panicum miliaceum L.）across Eurasia[J].Molecular Ecology，2011，22：4756-4771.

［17］連帥，王瑞云，馬躍敏，等.不同生態(tài)區(qū)糜子種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析 [J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，35（3）:225.

［18］劉笑瑜，王瑞云，劉敏軒，等.利用SSR標記分析40份糜子資源的遺傳多樣性[J].分子植物育種，2016，14（6）：1631-1636.

［19］王瑞云，劉笑瑜，王海崗，等.用高基元微衛(wèi)星標記分析中國糜子遺傳多樣性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（20）：3848-3859.

［20］張東輝，史國敏.分子標記在大豆遺傳育種中的實踐[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（8）：1381-1383.

［21］孫亞莉，何守樸，陳瓊玲，等.SSR標記與棉花產(chǎn)量性狀雜種優(yōu)勢的相關(guān)性分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：591-595.