甘薯渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)富含賴氨酸的菌體蛋白

夏 軍, 章 茜, 袁麗亞, 王新風(fēng), 徐繼明

(1.淮陰師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 淮安 223300; 2.淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 淮安 223300)

0 引言

甘薯在江蘇省淮安市有300多年的栽培歷史,既是傳統(tǒng)的糧、飼兼用作物,又是目前具有明顯區(qū)域生產(chǎn)優(yōu)勢的專用經(jīng)濟作物,年種植面積穩(wěn)定在兩萬公頃左右[1]．以甘薯為原料加工粉絲是當(dāng)?shù)匾豁椫匾?jīng)濟產(chǎn)業(yè),據(jù)統(tǒng)計,淮安市境內(nèi)有淮陰區(qū)趙集粉絲廠和洪澤縣西順河粉絲廠兩家龍頭加工企業(yè),中小型加工粉絲企業(yè)105個,甘薯加工專業(yè)戶近千個,粉絲的年供應(yīng)量達5 000噸左右．甘薯加工為粉絲后,遺留下大量薯渣,由于薯渣有機質(zhì)和水分含量高,容易腐敗變質(zhì)產(chǎn)生惡臭氣味,粉絲加工廠通常將其作為廢渣作掩埋處理,導(dǎo)致土壤和地下水的嚴(yán)重污染,加重了當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)面源污染．

除了做掩埋處理,當(dāng)前處理薯渣的一個可行方法是將其作為飼料飼喂畜禽．然而,由于薯渣中纖維素含量高,蛋白含量低,直接用作飼料,適口性差．此外,薯渣儲存過程中可能被病原微生物污染變質(zhì),將其飼喂牲畜存在致使畜禽患病死亡的可能[2]．因此,薯渣直接飼喂禽畜可謂弊端重重．近年來,通過微生物發(fā)酵技術(shù),將廢棄薯渣轉(zhuǎn)化為菌體蛋白飼料,成為薯渣資源化利用的一條重要途徑[3]．微生物發(fā)酵技術(shù)改變了薯渣原來的物理化學(xué)性質(zhì),將其所含的粗纖維降解為單糖、多糖、氨基酸等小分子物質(zhì),細菌、酵母菌等利用這些營養(yǎng)物質(zhì)大量繁殖菌體,菌體蛋白就是從酵母或者細菌等微生物菌體中獲取的蛋白質(zhì)．目前相關(guān)研究已見諸報道,如Aziz等以甘薯渣的酸水解液為底物,接種串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的混合菌進行固態(tài)發(fā)酵,發(fā)酵3天后,薯渣中的菌體生物量達13.96 g/L[4]．湯燕花、謝必峰等使用啤酒酵母和黑曲霉的混合菌固態(tài)發(fā)酵木薯渣,薯渣蛋白含量由3%～4%提高至15%左右,氨基酸總量提升至5.2%[5]．微生物細胞中含有豐富的蛋白質(zhì),例如酵母菌蛋白質(zhì)含量占細胞干物質(zhì)的45%～55%;細菌蛋白質(zhì)占干物質(zhì)的60%～80%[6]．因此,應(yīng)用微生物發(fā)酵技術(shù)可對薯渣進行深度生化加工,提高薯渣飼料的消化吸收率．

以薯渣為原料制備菌體蛋白飼料,雖然蛋白質(zhì)含量得到較大提高,但是由于菌體蛋白是由植物性原料發(fā)酵轉(zhuǎn)化而來,這些植物性的菌體蛋白(大豆除外)中必需氨基酸的含量極低,如賴氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸等．研究表明,如果蛋白飼料中長期缺乏某一種或幾種必需氨基酸,會使畜禽生長停滯,體重下降,降低飼料中其他成分的利用率,因此,合理調(diào)節(jié)飼料中氨基酸配比,對促進畜禽生長發(fā)育,提高飼料利用率具有重要意義[7]．一般認為,賴氨酸是玉米-豆粕型糧食的第一限制性氨基酸[8]．味之素動物營養(yǎng)集團于1999～2001年對全球21個國家379個具有代表性的豬飼料中賴氨酸和粗蛋白含量進行化驗分析,結(jié)果表明各國飼料的蛋白質(zhì)含量差異不大,但是我國飼料賴氨酸含量明顯偏低[9]．賴氨酸是影響機體代謝、生產(chǎn)性能和飼料成本的核心因素之一,其在畜禽體內(nèi)最重要的作用是合成體蛋白(如肌肉蛋白)、各種酶類以及多肽激素等.

本文以廢棄薯渣為底物,在常規(guī)發(fā)酵菌株中添加賴氨酸產(chǎn)生菌株進行固態(tài)發(fā)酵,開展混菌發(fā)酵制備富含賴氨酸的菌體蛋白飼料的研究,目的是提高菌體蛋白飼料中第一限制氨基酸賴氨酸含量,降低蛋白飼料的生產(chǎn)成本,為薯渣廢棄物的資源化利用提供可行的途徑．

1 材料與方法

1.1 菌株和發(fā)酵原料

瑞氏木霉Trichoderma reesei HA-1和北京棒桿菌Corynebacterium pekinense HA-3C,由淮安百麥綠色生物能源有限公司提供．產(chǎn)朊假絲酵母Candida utilis,購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC No.1807)．甘薯渣為淮安市趙集粉絲廠生產(chǎn)粉絲的廢渣,簡單清洗后曬干,粉碎過20目標(biāo)準(zhǔn)篩備用．

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

瑞氏木霉HA-1保存于PDA培養(yǎng)基,產(chǎn)朊假絲酵母1807保存于YPD培養(yǎng)基,北京棒桿菌HA-3C保存于LB培養(yǎng)基．

1.2.2 子培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基A:葡萄糖10 g/L,酵母粉1 g/L,KH2PO42 g/L,(NH4)2SO41.5 g/L,尿素 0.3 g/L,CaCl20.4 g/L,MgSO40.3 g/L,FeSO45 mg/L, MnSO41.5 mg/L, ZnSO41.5 mg/L, CoCl22 mg/L．種子培養(yǎng)基B:YPD液體培養(yǎng)基．種子培養(yǎng)基C:葡萄糖20 g/L,酵母粉5 g/L,(NH4)2SO45 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO40.5 g/L,pH 7.0．

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

薯渣50%,麩皮50%,作為發(fā)酵基質(zhì)．以發(fā)酵基質(zhì)100%為基準(zhǔn),加入糖蜜5%,豆餅浸粉3%,(NH4)2SO41%,KH2PO40.2%,MgSO40.05%．基質(zhì)初始含水量70%,自然pH值．

1.3 發(fā)酵方法

1.3.1 搖瓶種子的制備

在250 mL三角瓶中加入50 mL種子培養(yǎng)基,滅菌．將瑞氏木霉HA-1接種于種子培養(yǎng)基A,30℃,200 5rpm培養(yǎng)48 h．將產(chǎn)朊假絲酵母1807接種于YPD液體培養(yǎng)基,30℃,200 rpm培養(yǎng)24 h．將北京棒桿菌HA-3C接種于種子培養(yǎng)基C,30℃,200 rpm培養(yǎng)48 h．

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵

在250 mL三角瓶中加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基,其中基質(zhì)15 g．將瑞氏木霉HA-1種子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,48 h后接種產(chǎn)朊假絲酵母1807和北京棒桿菌HA-3C,30℃發(fā)酵120 h．總接種量15%(v:w),接種體積比為瑞氏木霉HA-1:產(chǎn)朊假絲酵母1807:北京棒桿菌HA-3C=2:1:2．

1.3.3 正交優(yōu)化實驗

使用正交方法設(shè)計實驗,進行3因素3水平正交實驗,基質(zhì)比例(A)、糖蜜濃度(B)和豆餅浸粉濃度(C)．A因素的3個水平分別為3/7,5/5和7/3；B因素的3個水平分別為3%,5%和7%；C因素的3個水平分別為1%,2%和3%．正交實驗在250 mL三角瓶中進行,發(fā)酵條件同上．

1.4 分析方法

1.4.1 發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量

取發(fā)酵產(chǎn)物適量,用蒸餾水洗滌3次,離心棄上清液,以去除其中的無機氮,沉淀物采用凱式定氮法(GB/6432-94)測定總氮含量,總氮含量乘以6.25,即得粗蛋白含量．

1.4.2 發(fā)酵產(chǎn)物中的賴氨酸含量

取發(fā)酵產(chǎn)物適量,加入10倍體積去離子水,200 rpm,30℃搖床震蕩30 min,取上清用高效液相色譜法測定賴氨酸含量．色譜柱:Hypersil AA-ODS column(2.1 mm×200 mm,Agilent Technologies,USA),柱溫40℃,流速0.45 mL/min,338 nm紫外檢測．流動相:20 mmol/L乙酸鈉和0.018%三乙胺的水溶液,用1%～2%乙酸調(diào)節(jié)pH至7.2,此為流動相A;100 mmol/L乙酸鈉,1%～2%乙酸調(diào)節(jié)pH至7.2,然后加入兩倍體積的乙腈和2倍體積的甲醇,此為流動相B．將鄰苯二甲醛作為柱前衍生劑,將鄰苯二甲醛與待測樣品在緩沖液中混合反應(yīng),然后進樣色譜柱進行分析,柱前衍生由高效液相色譜儀完成．以A相和B相的混合液作為流動相,B相初始體積比為0,隨后逐漸上升至100%,梯度洗脫．

2 結(jié)果與討論

2.1 基質(zhì)組成和外源添加物對固態(tài)發(fā)酵的影響

研究中利用霉菌將薯渣中的木質(zhì)纖維素降解為單糖,供酵母菌和北京棒桿菌使用,考慮到薯渣中容易被微生物直接吸收利用的營養(yǎng)成分含量較少,可能無法滿足酵母菌和北京棒桿菌菌體增殖的需要,因此需要外源添加營養(yǎng)成分．另一方面,甘薯渣吸水性較強,作為固態(tài)發(fā)酵唯一基質(zhì),會導(dǎo)致氧氣和水分流通困難,因此將薯渣與麩皮復(fù)配作為發(fā)酵基質(zhì)．考察結(jié)果如圖1所示,外源添加的幾種碳源(添加量5%)中,葡萄糖添加后發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量最高,達到11.3±0.4%,添加糖蜜發(fā)酵后賴氨酸含量最高,達到0.86±0.03%．考慮到添加糖蜜后,發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量與添加葡萄糖相比相差不大,并且糖蜜的價格要比葡萄糖低,因此選擇糖蜜作為外源添加的碳源．

在外源添加的幾種氮源(添加量2%)中,添加蛋白胨和酵母粉效果最佳,相比之下,添加豆餅浸粉后發(fā)酵粗蛋白含量9.7±0.3%,賴氨酸含量0.72±0.05%,雖然效果不是最佳,但是與蛋白胨和酵母粉相比差距不大,并且豆餅浸粉的價格較為低廉,因此選擇豆餅浸粉作為外源添加氮源．

考察了不同比例的薯渣:麩皮作為基質(zhì)(不添加碳源和氮源),對固態(tài)發(fā)酵的影響,結(jié)果顯示基質(zhì)的構(gòu)成對實驗結(jié)果具有重要影響．當(dāng)薯渣：麩皮比例(w：w)為5：5時效果最好,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量4.6±0.3%,賴氨酸含量0.35±0.02%．

2.2 正交試驗優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成

根據(jù)單因素考察的實驗結(jié)果,進一步開展了基質(zhì)組成、碳源和氮源的正交試驗,以優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成,按照3因素3水平設(shè)計正交試驗表,結(jié)果如表1所示,極差分析結(jié)果見表2．

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 極差分析表

圖1 外源添加碳源(a)、氮源(b)以及基質(zhì)組成(c)對固態(tài)發(fā)酵的影響

根據(jù)極差R判斷,對于粗蛋白含量這一指標(biāo),因素的影響力大小順序為A>C>B,通過K值判斷最大粗蛋白含量對應(yīng)的最適條件為A2B2C3．對于賴氨酸含量這一指標(biāo),因素的影響力大小順序為A>B>C,最大賴氨酸含量對應(yīng)的最適條件為A2B3C1．研究使用正交優(yōu)化的目的,是發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量和賴氨酸含量同時取得較高水平,最大粗蛋白含量和賴氨酸含量均是對應(yīng)于A2,因此A因素取第2水平;B因素在第2、第3水平之間選擇,考慮到取B2水平時蛋白質(zhì)含量平均值10.3%,賴氨酸含量平均值0.75%,取B3時蛋白質(zhì)平均值9.67%,賴氨酸平均值0.84%．兩種情況下賴氨酸含量變化不大,若取B3,蛋白質(zhì)損失較大,故B因素取第2水平比較合適,同理,C因素取第3水平．因此,正交優(yōu)化條件為A2B2C3,在此條件下進行發(fā)酵實驗驗證,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量為13.0%,賴氨酸含量0.87%,較優(yōu)化前顯著提高．

2.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 接種比例對混菌固態(tài)發(fā)酵的影響

為了進一步提高混菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白和賴氨酸含量,根據(jù)前期單因素實驗和正交試驗結(jié)果,對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化．首先對種子液中各個菌種的接種比例(v:v)進行了優(yōu)化,結(jié)果如圖2所示,當(dāng)種子液中霉菌、酵母菌和北京棒桿菌最優(yōu)體積比為2:1:2,此時薯渣發(fā)酵后粗蛋白含量達到14.3±0.3%,賴氨酸含量為0.96±0.06%．原因可能是,霉菌的作用是分解薯渣中的木質(zhì)纖維素為單糖,因此接種較多的霉菌可以為酵母菌和北京棒桿菌提供充足的碳源．

2.3.2 接種量對混菌固態(tài)發(fā)酵的影響

接種量對于固態(tài)發(fā)酵具有重要影響,合適的接種量可以保證菌體的快速增殖,然而,過高的接種量則會導(dǎo)致菌體生長過快,抑制產(chǎn)物合成[10]．研究考察了接種量6%～21%(v:w)對混菌固態(tài)發(fā)酵的影響,如圖3所示,最優(yōu)接種量為15%(v:w),薯渣發(fā)酵后粗蛋白含量達到15.5±0.5%,賴氨酸含量為1.12±0.04%．

2.3.3 基質(zhì)含水量對混菌固態(tài)發(fā)酵的影響

考察了基質(zhì)含水量對固態(tài)發(fā)酵的影響．含水量也是固態(tài)發(fā)酵中一個重要影響因素,基質(zhì)含水量過高,會對固態(tài)發(fā)酵過程中氧氣傳遞產(chǎn)生阻礙,含水量過低,則會影響基質(zhì)中營養(yǎng)成分的擴散傳遞[11]．研究考察了含水量50%～75%(v:w)對混菌固態(tài)發(fā)酵的影響如圖4所示. 最優(yōu)含水量為70%,薯渣發(fā)酵后粗蛋白含量達到16.8±0.4%,賴氨酸含量為1.32±0.06%．

圖2 接種比例對固態(tài)發(fā)酵的影響 圖3 接種量對固態(tài)發(fā)酵的影響

圖4 含水量對固態(tài)發(fā)酵的影響

3 結(jié)論

以廢棄薯渣為原料,以瑞氏木霉、產(chǎn)朊假絲酵母和北京棒桿菌混菌進行固態(tài)發(fā)酵,生產(chǎn)富含賴氨酸的菌體蛋白,為實現(xiàn)甘薯渣資源化利用、解決廢棄薯渣引起的環(huán)境問題提供新的思路．研究對固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,得到以下結(jié)論:

1) 向薯渣中添加麩皮作為發(fā)酵基質(zhì),同時外源添加價格低廉的糖蜜和豆餅浸粉,可以顯著提高固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白和賴氨酸含量．正交實驗結(jié)果顯示,基質(zhì)組成、糖蜜添加量、豆餅浸粉添加量3個因素中,基質(zhì)組成對發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白和賴氨酸含量的影響最大．正交實驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基中,薯渣與麩皮比例(w:w)為5:5,糖蜜添加量5%,豆餅浸粉添加量3%．

2) 進一步對固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,當(dāng)種子液中霉菌、酵母菌和北京棒桿菌的最優(yōu)體積比為2:1:2,總接種量15%(v:w),基質(zhì)含水量為70%時,薯渣發(fā)酵后粗蛋白含量達到16.8%,賴氨酸含量為1.32%,較優(yōu)化前顯著提高．

[1] 李兆勇, 王興龍, 陳宗明. 江蘇省淮安市甘薯產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及其發(fā)展對策[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 3: 56-57.

[2] 李瑩. 薯渣飼料中增加賴氨酸含量的工藝及相關(guān)生物信息學(xué)分析[D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2011.

[3] Mayer F, Hillebrandt J O. Potato pulp: microbiological characterization, physical modifcation, and application of this agricultural waste product[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1997, 48: 435-440.

[4] Aziz N H, Mohsen G I. Bioconversion of acid and gamma-ray-treated sweet potato residue to microbial protein by mixed cultures[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2002, 29(5): 264-267.

[5] 湯燕花, 謝必峰. 利用木薯渣發(fā)酵生產(chǎn)啤酒酵母單細胞蛋白的研究[J]. 藥物生物技術(shù), 2006,13(1): 51-54.

[6] 郭雪山, 肖玫. 單細胞蛋白的應(yīng)用及其開發(fā)前景[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2006, 5: 23-24.

[7] Hauler R C, Carter C G. Revaluation of the quantitative dietary lysine requirements of fish[J]. Rev Fish Sci， 2001, 9(3): 133-163.

[8] Abimorad E G, Favero G C, Squassoni G H, et al. Dietary digestible lysine requirement and essential amino acid to lysine ratio for pacu Piaractus mesopotamicus[J]. Aquacult Nutr， 2010, 16: 370-377.

[9] 喬巖瑞, 孫鳴, 婁永軍. 氨基酸平衡合理化是飼料行業(yè)亟待解決的問題[J]. 中國飼料, 2004,8: 6-8.

[10] Sabu A, Swati C, Pandey A. Tannase production by Lactobacillus sp. ASR-S1 under solid-state fermentation[J]. Proc Biochem, 2006, 41: 575-580.

[11] Pandey A. Solid-state fermentation[J]. Biochem Eng J, 2003,13: 81-84.