不同蛋白酶對天龍粉水解作用的比較研究

王 穎 王立娜 劉春雨 王 靜 黃志強 張由芹 朱明珠 蔡梅超

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355)

天龍別名壁虎、守宮，為壁虎科動物無蹼壁虎(GekkoswinhonisGunther)等的全體[1]，味咸性寒，具有祛風定驚、散結(jié)解毒、通絡(luò)止痛等功效。近代研究表明，天龍具有抗腫瘤的作用，壁虎中主要含有與馬峰毒相似的有毒物質(zhì)以及組織胺類和蛋白質(zhì)類成分?，F(xiàn)代藥理研究表明,動物類藥材發(fā)揮作用的主要為其小分子肽[2～4]，動物藥在酶解之后其生物活性普遍高于原品[5～7]。顧響響[8]等研究表明，鮮壁虎酶解后增加了鮮壁虎粗提物對小鼠H22移植瘤的抑制作用。

本文以天龍凍干粉為底物，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶5種蛋白酶進行水解，同時以水提天龍粉作為對照組，測定每種蛋白酶的水解度，評價5種蛋白酶對天龍粉的水解效果，為天龍抗腫瘤活性成分及天龍加工方法的改進提供新思路，為臨床用藥提供新途徑。

1 實驗材料

1.1 試劑

胰蛋白酶、 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、甘氨酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶( 上海源葉生物科技有限公司)；茚三酮、果糖、鄰苯二甲酸氫鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、0.1 mol/l 鹽酸標準滴定溶液40%氫氧化鈉溶液、4%硼酸溶液；所有試劑均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。

1.2 儀器

KDN-2C 定氮儀配四孔消化爐( 上海纖檢儀器有限公司)；PHS-25型pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司； UV9100B 可見分光光度計( 北京萊伯泰科儀器有限公司)等。

1.3 藥材

天龍購自安徽亳州市，天龍粉為冷凍干燥天龍粉，批號為20150801。

2 方 法

2.1 天龍粉水解液的制備

稱取天龍凍干粉6份，每份精密稱取1.000 0 g，分別加入250 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶30加入定量蒸餾水，超聲提取30 min，按表1進行實驗。分別得到6種天龍粉酶解粗液，然后分別在3 000 r/min條件下，離心10 min，抽濾，定容至100 mL，得最終天龍酶解液。

表1 5種蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of five kinds of protease

2.2 茚三酮顯色法測定蛋白質(zhì)的水解度

2.2.1標準曲線的繪制

精密稱取茚三酮0.5 g，磷酸氫二鈉10 g，果糖0.3 g，磷酸二氫鉀6 g，用40%乙醇溶液，定容至100 mL，即得茚三酮顯色劑。

精密稱取干燥過的甘氨酸0.100 0 g，加蒸餾水溶解后定容至100 mL，然后再取出2 mL定容到100 mL容量瓶中,即得 20 ug/mL 的溶液，分別量取0、1、2、3、4、5 mL定容到10 mL的容量瓶中,再分別從各稀釋液取2 mL于試管中，加入1.00 mL顯色劑，混勻，在沸水浴中加熱15 min，在冷水中迅速放涼，各加入5 mL40%乙醇溶液，混勻后，放置15 min,在570 nm處用分光光度計測定吸光度A，繪制標準曲線。

2.2.2樣品中游離氨基酸含量測定

將6種天龍粉水解液適量定量，按照一定的稀釋倍數(shù)稀釋到適宜的濃度，按照“2.2.1”方法測定樣品的吸光度A，并計算樣品中游離氨基酸的含量。

2.3 水解度的測定

用茚三酮法測定水解液中的游離氨基肽氮含量，用凱氏定氮法測定原料中總氮量，按照下式計算水解度。

式中：A：料中的總氮數(shù)；B：水解液中的氨基氮數(shù)；C：原料中游離的氨基氮數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 氨基肽氮含量的測定

3.1.1標準曲線的繪制

以吸光度為橫坐標，以甘氨酸標準溶液的-NH2濃度(μg/mL)為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為：Y=4.978X-0.028，相關(guān)系數(shù)r2=0.9984。

3.1.2樣品中氨基肽氮的含量測定結(jié)果

如表2所示。

表2 水解液中的氨基肽氮含量Tabke 2 Content of amino nitrogen in Hydrolysate

3.2 樣品的水解度測定結(jié)果

用凱氏定氮法測定1.000 0 g原料中總氮的含量為21.679 mg/mL。根據(jù)公式計算出四種蛋白質(zhì)的水解度，結(jié)果如圖1所示，彈性蛋白酶的水解能力最高，DH為73.18%，胃蛋白酶的水解度為76.33%，木瓜蛋白酶的水解度為57.34%，胰凝乳蛋白酶的水解度較低，DH為34.05%。胰蛋白酶的水解度最低，DH為29.68%。

圖1 五種蛋白酶的水解度Fig 1 Hydrolysis degree of five kinds of proteases

4 討 論

本研究利用五種不同的酶將天龍粉酶解，其中經(jīng)彈性蛋白酶和胃蛋白酶酶解后的水解度較高，木瓜蛋白酶的水解度次之，而胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶的水解度較低。這是不同種類的酶具有不同的酶切位點。胃蛋白酶是胃中主要消化的蛋白酶，能夠水解芳香族或其他疏水氨基酸的羧基或氨基形成的肽鍵；彈性蛋白酶具有廣泛的水解活性對明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質(zhì)都有降解作用，是一種廣譜的肽鏈內(nèi)切酶[9]，能夠水解丙氨酸、甘氨酸及短脂肪鏈氨基酸的羧基形成的肽鍵；胰蛋白酶是小腸中主要消化的蛋白酶，只是專一地水精氨酸、解賴氨酸羧基形成的肽鍵；胰凝乳蛋白酶是專一地水解由芳香族氨基酸或帶有較大非極性側(cè)鏈的氨基酸羧基形成的肽鍵；木瓜蛋白酶是食品工業(yè)中常用的蛋白酶，具有較寬的底物特異性，作用于蛋白質(zhì)中的L-精氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸殘基羧基參與形成的肽鏈。

很多研究表明，動、植物中的小分子肽具有很好的抗腫瘤效果。有研究表明，某些動物藥經(jīng)酶解后釋放出活性多肽，表現(xiàn)出更強的生物活性，因此，從動物藥酶解產(chǎn)物中發(fā)掘出高效低毒的活性多肽，可能是新藥發(fā)現(xiàn)的一條新途徑。本研究考察不同酶對天龍粉的酶解效果，以水解度為評判指標，可以為下一步藥理實驗探究天龍不同酶解物的抗腫瘤效果，提供參考，也可以為下一步天龍抗腫瘤活性成分及天龍加工方法的改進提供新思路，為臨床用藥提供新途徑。

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