甜菜M14品系鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)錄因子分析

端木慧子，陶 鑫，王建慧，韋 恒，李海英，馬春泉,*

(黑龍江大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院;b. 黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150080)

鹽脅迫是制約植物生長發(fā)育的重要因素之一，鹽漬化的土地在中國的東北、華北、西北地區(qū)廣泛存在，因此培育和研究耐鹽作物對提高農(nóng)作物產(chǎn)量有著重要的意義[1]。在植物抵御非生物脅迫過程中，植物轉(zhuǎn)錄因子扮演著重要的角色，它調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的表達，是植物適應(yīng)外界環(huán)境的分子基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達調(diào)控的關(guān)鍵步驟[2]。

甜菜M14品系是郭德棟等通過二倍體栽培甜菜和四倍體野生白花甜菜進行雜交和回交得到的甜菜單體附加系，研究表明甜菜M14品系具有野生白花甜菜抗寒、抗旱、耐鹽及無融合生殖等優(yōu)良特性[3-6]。實驗室前期通過對0、200、400 mM NaCl處理下甜菜M14品系根和葉的轉(zhuǎn)錄組測序得到甜菜M14品系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。

研究發(fā)現(xiàn)參與鹽脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子主要都是來自AP2/ERF、MYB、WRKY、NAC、bZIP、HD-ZIP這6個基因家族。WRKY家族是僅存在于植物中，在非生物脅迫以及生物脅迫中起著各種各樣的作用。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與其下游靶基因和上游調(diào)節(jié)基因之間的相互作用和交互作用構(gòu)成了復(fù)雜的 WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這是研究界的新興領(lǐng)域之一[7-9]。前人對擬南芥、棉花、水稻等植物的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子做了大量的研究，如小麥中的TaERKY70在小麥抗條銹菌的過程中起著重要的作用，當(dāng)其被沉默時會導(dǎo)致植株對小麥條銹病的敏感性增高[10]；棉花GhWRKY68與ROS的積累、MDA含量升高以及ROS相關(guān)基因的表達相關(guān)[11]；研究發(fā)現(xiàn)WRKY在植物激素赤霉素和脫落酸介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[12]。棉花、擬南芥、水稻中分別有17、18、26個WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)鹽脅迫[13-15]，但很少有人對甜菜WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子進行研究。

本研究對課題組前期構(gòu)建的甜菜M14品系鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行系統(tǒng)的分析，基于文獻、植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫等信息對其中的轉(zhuǎn)錄因子進行篩選與鑒定，從而獲得非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。進一步對篩選出的轉(zhuǎn)錄因子WRKY家族進行進化分析并構(gòu)建其蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，采用Real-time PCR技術(shù)分析WRKY基因家族轉(zhuǎn)錄因子鹽脅迫前后表達量，初步探究WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子在甜菜M14抗鹽脅迫機制中的表達模式，為其進一步功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的實驗材料為甜菜M14品系(公開號：CN1263695A)、甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄因子分類

通過植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫、非冗余Nr庫和Swissprot數(shù)據(jù)庫中的信息篩選甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄因子，并進行分類。將分類完成的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因序列一一查找并對應(yīng)到KEEG注釋的代謝通路中所標(biāo)識的位置。

1.2.2 甜菜M14品系WRKY轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)生分析

將甜菜M14品系數(shù)據(jù)庫中的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子的序列在NCBI在線Blastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行分析，選取與甜菜WRKY親緣較近的物種的WRKY核酸序列進行比對分析，用MEGA6.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.3 甜菜M14品系WRKY轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)String10.0數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org/)構(gòu)建甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 甜菜M14品系WRKY轉(zhuǎn)錄因子鹽脅迫下基因表達分析

分別提取0、200、400 mM NaCl處理下甜菜M14品系葉組織的總RNA，DNase純化處理后及濃度稀釋均一后，分別取1.0 μL總RNA，采用TaKaRa RNA PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)崟r熒光定量PCR反應(yīng)使用TaKaRa公司的SYBR染料，在Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀上進行。甜菜M14品系WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因的擴增以18S rRNA基因作為內(nèi)參并采用相同的反應(yīng)體系，其中上游引物標(biāo)注為18S，下游引物標(biāo)注為18AS，WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因上游引物標(biāo)注為F，下游引物標(biāo)注為R，數(shù)字代表基因編號(表1)，每個反應(yīng)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)和3次生物重復(fù)。以0 mM NaCl處理下甜菜M14品系WRKY家族基因的Ct值為對照組，進行數(shù)據(jù)分析。

表1 Real time PCR引物名稱和序列

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄因子家族分類

參照植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫和文獻，對甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄因子進行分類。在甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，Nr功能注釋下的數(shù)據(jù)庫表格中篩選出了768個轉(zhuǎn)錄因子，Swissprot功能注釋下的數(shù)據(jù)庫表格中篩選出了541個轉(zhuǎn)錄因子，將Nr與Swissprot的轉(zhuǎn)錄因子進行橋接獲得了623個轉(zhuǎn)錄因子，包含34個轉(zhuǎn)錄因子家族(表2)。

表2 甜菜M14品系數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄因子家族分類

根據(jù)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)將這623個轉(zhuǎn)錄因子按功能分類可分為5類，即生長發(fā)育、生物與非生物脅迫、信號傳導(dǎo)、染色質(zhì)及染色體形成和其它(表3)。

表3 甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄因子家族功能分類

2.2 數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄因子的KEGG代謝通路分析

甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄因子KEEG注釋的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子參與植物的各種代謝途徑，其中參與調(diào)節(jié)植物晝夜節(jié)律和植物抵抗病原體通路的轉(zhuǎn)錄因子最多，WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子則在植物切除修復(fù)的通路上發(fā)揮著重要作用(表4)。通過對應(yīng)KEGG的代謝通路，可以初步了解不同轉(zhuǎn)錄因子家族在不同的代謝通路中的作用，為以后實驗驗證，以及改良物種有很好的作用。

2.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子及近緣物種系統(tǒng)進化樹

對甜菜M14品系的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子及其他物種的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示甜菜M14品系的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系最近(圖1)。

2.4 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

表4 甜菜M14品系轉(zhuǎn)錄因子的KEGG代謝通路

轉(zhuǎn)錄因子是高等植物生命活動中不可或缺的調(diào)控因子，具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系。根據(jù)甜菜M14品系中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的擬南芥同源基因，利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建WRKY蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，甜菜WRKY3、WRKY13、WRKY15、WRKY32的擬南芥同源基因均具有多個互作的蛋白質(zhì)，形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(圖2)，因此這些WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能行使比較重要的功能。

圖1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)物種系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of WRKY transcriptional factors

圖2 擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的STRING分析圖Fig.2 Phylogenetic tree of WRKY transcriptional factors

圖3 鹽脅迫下WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因Real-time定量結(jié)果Fig.3 Real-time PCR results of WRKY transcriptional factors of sugar beet M14 under NaCl stress

2.5 鹽脅迫下WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子基因的表達模式分析

根據(jù)Real time PCR的結(jié)果，計算2-△△Ct制作柱形圖，見圖3。由圖3可見，WRKY15和WRKY53受到低濃度鹽脅迫的抑制，在高濃度鹽脅迫下上調(diào)；WRKY32、WRKY3、WRKY13在低濃度和高濃度鹽脅迫下表達量都上調(diào)。WRKY23、WRKY27、WRKY74在低濃度鹽脅迫下不表達，高濃度鹽脅迫下表達上調(diào)。

3 討 論

本研究在甜菜M14品系0 、200、400 mM NaCl濃度脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，共篩選到了623個轉(zhuǎn)錄因子，分屬34個家族。按照功能可將其分為參與植物生長發(fā)育、響應(yīng)生物與非生物脅迫、參與信號傳導(dǎo)、調(diào)控染色質(zhì)及染色體的形成和其它5大類，其中有9個WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有響應(yīng)生物與非生物脅迫功能。

WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、玉米、大豆等作物響應(yīng)脅迫的過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，但很少有人對甜菜中的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子進行過研究。因此，本實驗對甜菜M14品系中的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子WRKY15、WRKY32、WRKY3、WRKY13、WRKY53、WRKY23、WRKY27和WRKY74進行了系統(tǒng)的分析。結(jié)果顯示，WRKY3、WRKY13、WRKY15和WRKY32同源的擬南芥WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子具有復(fù)雜的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，具有多個互作蛋白質(zhì)；WRKY15、WRKY32、WRKY3、WRKY13、WRKY53、WRKY23、WRKY27和WRKY74的表達均受到NaCl的誘導(dǎo)，而且可以推測甜菜M14品系WRKY32、WRKY3、WRKY13在NaCl脅迫下穩(wěn)定的誘導(dǎo)表達，WRKY23、WRKY74和WRKY27的表達則具有相互補充的作用，即在低濃度NaCl(200 mM)脅迫下WRKY27受到大量誘導(dǎo)，在高濃度NaCl(400 mM)脅迫是WRKY23、WRKY74受到大量誘導(dǎo)。

2008年Zhou等將大豆中的3個轉(zhuǎn)錄因子GmWRKY13、GmWRKY21和GmWRKY54在擬南芥中過表達， 發(fā)現(xiàn)在200 mM NaCl脅迫下GmWRKY13的過表達植株可抗鹽害[16]。筆者的結(jié)果同樣顯示，甜菜M14品系中的轉(zhuǎn)錄因子WRKY13在200、400 mM NaCl處理下表達量均發(fā)生上調(diào)，表明甜菜M14品系中轉(zhuǎn)錄因子WRKY13可能是響應(yīng)鹽脅迫的正調(diào)控因子。Wei 等將遏藍菜中的TcWRKY53轉(zhuǎn)錄因子在煙草中過表達后發(fā)現(xiàn)TcWRKY53是響應(yīng)滲透脅迫的負(fù)調(diào)控因子[17]。眾所周知，NaCl脅迫往往會伴隨著滲透脅迫的發(fā)生，筆者發(fā)現(xiàn)在200 mM NaCl脅迫下轉(zhuǎn)錄因子WRKY53的表達量下調(diào)，表明甜菜M14品系中轉(zhuǎn)錄因子WRKY53可能是響應(yīng)低鹽脅迫的負(fù)調(diào)控因子。

另外，甜菜M14品系中的轉(zhuǎn)錄因子WRKY15、WRKY3、WRKY32、WRKY23、WRKY27和WRKY74在鹽脅迫下表達量也均發(fā)生變化，但在其它作物中并沒有報道，后續(xù)筆者將會對其功能進行進一步驗證。

4 結(jié) 論

本研究通過對前期構(gòu)建的甜菜M14品系鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行分析，結(jié)合已知的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫與注釋信息，對甜菜M14品系中的轉(zhuǎn)錄因子進行了分類與注釋，并對篩選到的響應(yīng)鹽脅迫的甜菜WRKY轉(zhuǎn)錄因子進行了蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析與表達分析，最終獲得了可能參與鹽脅迫應(yīng)答的甜菜WRKY轉(zhuǎn)錄因子。本研究將為甜菜鹽脅迫響應(yīng)研究提供理論基礎(chǔ)，為甜菜中轉(zhuǎn)錄因子研究提供數(shù)據(jù)支持，并為WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子功能的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

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