通心絡(luò)對(duì)2型糖尿病腎病大鼠纖溶調(diào)節(jié)因子PAI-1表達(dá)的影響

鄒大威 高彥彬 李嬌陽 周盛楠 張娜 吳曉明 田年秀 王曉磊 朱智耀

最新發(fā)表于《美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)雜志》(JAMA)的一項(xiàng)研究顯示，2013年中國(guó)大陸成年人糖尿病的總患病率約為10.9%，糖尿病前期的患病率為35.7%[1]。2型糖尿病并發(fā)腎病的患病率為34.7%[2]，也是糖尿病患者致死致殘的主要原因。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥，糖尿病患者血液處于高凝高粘狀態(tài)，由于血液黏度增高，血流緩慢，組織血液灌注量減少，致使組織缺血缺氧，局部代謝產(chǎn)物蓄積，導(dǎo)致腎內(nèi)微循環(huán)障礙。本研究在絡(luò)病學(xué)說指導(dǎo)下，基于中醫(yī)學(xué)“同病異治”理論，旨在探討通心絡(luò)對(duì)2型糖尿病腎病腎內(nèi)微循環(huán)、腎臟病理及腎功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 干預(yù)藥物與試劑

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)，通心絡(luò)超微粉(主藥為人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍等，由河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司提供)，鏈脲佐菌素(美國(guó)，sigma)，大鼠組織型纖溶酶原激活物Elisa試劑盒(CSB-E07917r，武漢華美)，大鼠纖溶酶原激活物抑制因子(CSB-E07948r，武漢華美)。

1.3 儀器

CareSens POP血糖儀(愛科來國(guó)際商貿(mào)有限公司)，自動(dòng)血液流變儀(LBY-N6K，北京普利生儀器有限公司)，毛細(xì)血管黏度針(LBY-NW1，北京普利生儀器有限公司)，血凝儀(C2000-4，北京普利生儀器有限公司)，毛細(xì)管離心機(jī)(KH-120M，日本)，臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16，上海安亭科學(xué)儀器廠)，血小板聚集儀(LBY-NJ4，北京普利生儀器有限公司)，卓越320、330全自動(dòng)生化分析儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方案

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素建立2型DN 大鼠模型，隨機(jī)選取SD大鼠10只為空白組，其余20只大鼠予以高脂飼料飼養(yǎng)4周后，禁食12小時(shí)，按照35 mg/kg體重一次性腹腔注射1%的鏈脲佐菌素，72小時(shí)后大鼠尾靜脈取血測(cè)血糖，空腹血糖(fasting blood glucoce，F(xiàn)BG)≥16.7 mmol/L視為糖尿病模型建立成功。造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為模型組(10只，等量蒸餾水灌胃)，通心絡(luò)組[10只，生藥0.4 g/(kg·d)灌胃]；空白組(10只，等量蒸餾水灌胃)，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水，連續(xù)給藥16周。

1.5 標(biāo)本收集及指標(biāo)檢測(cè)

給藥16周末，各組大鼠尾靜脈取血測(cè)定血糖。禁食12小時(shí)后，次日清晨末次給藥后以10%的水合氯醛麻醉(0.35 mL/100 g)，腹主動(dòng)脈取血，部分血樣用3.8%的枸櫞酸鈉抗凝，抗凝全血用于血小板、全血黏度的測(cè)定；部分血樣3000 r/min離心15分鐘以分離血漿，用于血漿黏度和血漿纖維蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。部分血樣不抗凝靜置2小時(shí)后分離血清測(cè)定肌酐、血清尿素氮及纖溶調(diào)節(jié)因子測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 通心絡(luò)對(duì)2型DN大鼠血糖、體重、腎功能的影響

如表1所示，與空白組相比，模型組大鼠的血糖明顯升高(P>0.05)、體重(body weight，BW)明顯降低(P<0.05)，通心絡(luò)能升高2型DN大鼠體重，但對(duì)血糖沒有影響(P>0.05)。與空白組相比，模型組大鼠的血肌酐、血尿素氮明顯升高(P<0.05)；通心絡(luò)給藥16周能夠降低DN大鼠血肌酐、 血尿素氮(P<0.05)，提示通心絡(luò)能夠保護(hù)2型DN大鼠腎功能。

表1 通心絡(luò)對(duì)2型DN大鼠血糖、體重及腎功能的影響

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2 通心絡(luò)對(duì)2型DN大鼠血液流變學(xué)的影響

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 通心絡(luò)對(duì)2型DN大鼠血液流變學(xué)的影響

如表2所示，與空白組相比，糖尿病大鼠高、低切變率下的全血黏度、血漿黏度、血漿纖維蛋白原含量、血小板聚集率均明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，通心絡(luò)干預(yù)降低上述血流變指標(biāo)(P<0.05)， 提示通心絡(luò)可通過改變血液流變學(xué)特性，降低血液的高凝狀態(tài)，增加腎組織的血液供應(yīng)，改善腎內(nèi)微循環(huán)。

2.3 通心絡(luò)對(duì)2型DN大鼠纖溶調(diào)節(jié)因子t-PA及PAI-1表達(dá)的影響

如表3所示，與空白組相比，模型組血漿組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogenemia activator, t-PA)降低，血漿纖溶酶原抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)增高；與模型組相比，給藥16周時(shí)通心絡(luò)組的血漿T-PA表達(dá)有升高的趨勢(shì)(P>0.05)，PAI-1明顯降低(P<0.05)。提示通心絡(luò)可通過降低血漿PAI-1水平，改善DN晚期大鼠纖溶活性，增加腎組織的血液供應(yīng)，改善腎內(nèi)微循環(huán)。

表3 通心絡(luò)對(duì)2型DN大鼠纖溶調(diào)節(jié)因子t-PA、PAI-1表達(dá)的影響

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.4 通心絡(luò)對(duì)2型DN大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡觀察可見：空白組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，腎小球基底膜均勻一致，足突排列整齊清晰，細(xì)胞外基質(zhì)區(qū)大小及系膜細(xì)胞數(shù)量正常；模型組：腎小球基底膜節(jié)段性不規(guī)則增厚，足突變形、低平甚至脫落，系膜基質(zhì)區(qū)擴(kuò)大，系膜細(xì)胞增多，腎間質(zhì)區(qū)可見纖維化表現(xiàn)。通心絡(luò)組較模型組的病理變化程度有所減輕。見圖1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素注射建立2型DN動(dòng)物模型，DN以腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化為主要病理特征，臨床表現(xiàn)為尿蛋白增多及腎功能進(jìn)行性惡化，本實(shí)驗(yàn)表明通心絡(luò)具有保護(hù)腎功能、改善腎臟病理的作用。

DN是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。目前認(rèn)為，DN會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞源性血管活性因子表達(dá)失調(diào)、血管舒縮功能失調(diào)、抗凝功能降低，纖溶活性下降。血液流變學(xué)是反映血液循環(huán)的重要指標(biāo)，其變化反映血液黏滯性及凝固性的改變[3]。本實(shí)驗(yàn)表明DN動(dòng)物模型的全血黏度、血漿黏度、血小板聚集率以及纖維蛋白原均明顯增加，血液處于高粘高凝狀態(tài)；通心絡(luò)干預(yù)可增加腎臟血流，改善DN大鼠腎內(nèi)微循環(huán)。tPA和PAI-1是纖溶系統(tǒng)中非常關(guān)鍵的一對(duì)活性物質(zhì)，tPA是纖溶酶源激活劑，而PAI-1是絲氨酸蛋白酶抑制劑，可迅速與tPA結(jié)合使其失去活性，抑制纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，抑制血漿纖溶活性。另外，纖溶酶減少可抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚，進(jìn)一步加重腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[4]。本研究顯示通心絡(luò)能夠減少血漿PAI-1含量，增強(qiáng)纖溶活性，減輕DN大鼠腎纖維化，延緩DN進(jìn)展。

DN臨床發(fā)病呈進(jìn)行性進(jìn)展，遷延難愈，易滯易瘀，與絡(luò)脈的結(jié)構(gòu)運(yùn)行及功能、發(fā)病特點(diǎn)相一致。吳以嶺院士[5]認(rèn)為糖尿病腎病病機(jī)是氣陰兩虛、陰虛燥熱、陰陽兩虛，消渴的早期是肺燥、胃熱多見，后期為腎虛，并繼發(fā)他臟病變，影響氣、血、水的運(yùn)行，導(dǎo)致氣滯、血瘀、水停為病，邪阻于腎絡(luò)，則腎絡(luò)不暢，從而產(chǎn)生絡(luò)脈郁滯、絡(luò)脈瘀阻、絡(luò)脈瘀塞、絡(luò)息成積等主要病理變化。本病屬于“久病入絡(luò)”“久病多瘀”，可歸屬于“絡(luò)病”范疇。瘀血內(nèi)阻是糖尿病腎病的基本病理改變，病在絡(luò)脈是糖尿病腎病的中心環(huán)節(jié)。通心絡(luò)是吳院士在絡(luò)病理論指導(dǎo)下研發(fā)的中藥復(fù)方，主要成分包括人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香、酸棗仁、冰片等十二味中藥，全方有益氣通絡(luò)、活血化瘀之效。人參為君藥，氣旺則血行，腎絡(luò)通暢，水蛭入絡(luò)活血、全蝎搜風(fēng)通絡(luò)止痙共為臣藥；佐以蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣等通絡(luò)蟲類藥收活血溫通，通絡(luò)止痙之功，冰片為使藥。臨床研究表明，通心絡(luò)能夠降低DN患者尿蛋白、保護(hù)腎功能，改善血流變特性[6-7]。中藥藥理研究表明人參具有抗纖維化的作用，全蝎、赤芍、水蛭具有抗凝、抗血栓、促纖溶、抑制血小板聚集的作用[8-10]；土鱉蟲、降香具有抗凝血作用[11-12]。通心絡(luò)能夠改善DN大鼠血液高凝高粘狀態(tài)，這與其他活血通絡(luò)復(fù)方的研究是一致的[13-15]。絡(luò)病是冠心病及糖尿病微血管并發(fā)癥等重大疾病的共性病理基礎(chǔ)。通心絡(luò)治療冠心病療效確切，同時(shí)能夠降低DN大鼠尿蛋白、保護(hù)腎功能，其對(duì)心、腎的共同保護(hù)作用體現(xiàn)了中醫(yī)“異病同治”的大法[16]。

綜上，通心絡(luò)具有抗凝、降纖的作用，可降低血液的高凝高黏狀態(tài)，改善腎臟局部微循環(huán)灌注，改善DN大鼠腎臟病理及保護(hù)腎功能，延緩DN進(jìn)展。

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