衍生化GC-MS法測定甲磺酸萘莫司他原料藥中甲磺酸甲酯與甲磺酸乙酯

劉曉強(qiáng),丁 建

(常州市食品藥品監(jiān)督檢驗中心,常州 213101)

甲磺酸萘莫司他(nafamostat mesilate)化學(xué)名為6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸鹽,是Japan Tobacco公司研發(fā)的非肽類蛋白酶抑制劑[1],首次上市是在1986年的日本,主治臨床急性胰腺炎[2-3]。在甲磺酸萘莫司他的制備工藝中,由于所用原料、試劑等多種因素影響,在制得的甲磺酸萘莫司他原料藥中可能會有甲磺酸甲酯(MMS)和甲磺酸乙酯(EMS)等雜質(zhì)生成[4-5]。而甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯等甲磺酸酯類化合物均具有較強(qiáng)的潛在性遺傳毒性雜質(zhì),嚴(yán)重威脅患者的健康,故需要對其含量進(jìn)行控制[5]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 GCMS-QP-2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；XS105DU電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 甲磺酸萘莫司他(江蘇杜瑞制藥有限公司,批號840901)；甲磺酸甲酯對照品(百靈威科技有限公司,批號LSB0N36,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)；甲磺酸乙酯對照品(阿法埃莎化學(xué)有限公司,批號10169291,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)；乙腈為色譜純(德國默克公司)；實驗用水為純凈水；碘化鈉和無水硫代硫酸鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：HP-INNOWAX(安捷倫科技有限公司,30 m×0.250 mm,0.50 μm)；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；柱溫：采用程序升溫法,起始溫度設(shè)為35 ℃,維持3 min,再以30 ℃·min-1的速率升溫至180 ℃,維持2 min；載氣類型：氦氣；載氣流速：恒壓模式(100 kPa)；進(jìn)樣量：1.0 mL；分流比：1∶12；平衡時間：30 min；進(jìn)樣方式：頂空進(jìn)樣；平衡溫度：60 ℃。

質(zhì)譜：離子源溫度：250 ℃；接口溫度：150 ℃；電離源：電子轟擊離子化(EI)；分析器：四級桿質(zhì)量分析器；離子源溫度：250 ℃。選擇性離子模式(SIM)檢測,碘代丁烷(BuI)定量離子m/z為184,碘代甲烷(MeI)為142,碘代乙烷(EtI)為156,BuI、MeI和EtI依次由甲磺酸丁酯(BMS)、甲磺酸甲酯(MMS)及甲磺酸乙酯(EMS)經(jīng)衍生化反應(yīng)形成。

2.2溶液的制備

2.2.1衍生化溶液 稱取碘化鈉60.0 g和無水硫代硫酸鈉30 mg,置于同一50 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(避光保存)。

2.2.2內(nèi)標(biāo)溶液 精密量取甲磺酸丁酯50 μL,置于50 mL量瓶中,用乙腈-水(8∶2)稀釋至刻度,搖勻；精密量取上述溶液500 μL,置于250 mL量瓶中,用乙腈-水(2∶8)稀釋至刻度,搖勻；再精密量取上述溶液100 mL,置于1 000 mL量瓶中,同樣用乙腈-水(2∶8)稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.3對照品儲備液 精密稱取甲磺酸甲酯及甲磺酸乙酯各25 mg,共同置于5 mL量瓶中,用甲苯溶解并稀釋至刻度,搖勻；精密量取上述溶液50 μL,移至25 mL量瓶中,加乙腈2 mL,用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度,制成每1 mL中含甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯各10 μg 的溶液,即得。

2.2.4對照品溶液(1) 精密量取2.2.3項下制備的對照品儲備液50 μL,置于50 mL量瓶中,用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度；依次精密量取2.2.1項下制備的衍生化溶液與上述溶液各0.5 mL,共同置于20 mL頂空瓶中,壓蓋密封,搖勻,即得。

2.2.5對照品溶液(2) 精密量取2.2.3項下制備的對照品儲備液150 μL,置于20 mL量瓶中,用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度；依次精密量取2.2.1項下制備的衍生化溶液與上述溶液各0.5 mL,共同置于20 mL頂空瓶中,壓蓋密封,搖勻,即得。

2.2.6供試品溶液 精密稱取本品25 mg,置于20 mL頂空瓶中,依次精密加入2.2.1項下制備的衍生化溶液與2.2.2項下制備的內(nèi)標(biāo)溶液各0.5 mL,壓蓋密封,搖勻,即得。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取2.2.3項下制備的對照品儲備液30,50,50,150和1 000 μL,分別置于100,50,20,20和50 mL量瓶中,用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度,使其質(zhì)量濃度分別為3,10,25,75 和200 ng·mL-1。再依次量取上述各溶液0.5 mL,與2.2.1項下制備的衍生化溶液0.5 mL,共同置于20 mL頂空瓶中,壓蓋密封。

結(jié)果表明,甲磺酸甲酯擬合曲線為y=0.015 5x+0.152 1,r=0.997 5；甲磺酸乙酯擬合曲線為y=0.016x+0.007 1,r=0.999 9。甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯質(zhì)量濃度在3.0～200.0 ng·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2檢出限和定量限 甲磺酸甲酯的定量限為2.892 8 ng·mL-1,信噪比為19.5∶1,檢測限為0.964 3 ng·mL-1,信噪比為16.5∶1；甲磺酸乙酯的定量限為3.022 3 ng·mL-1,信噪比為13.8∶1,檢測限為1.007 8 ng·mL-1,信噪比為9.7∶1。

2.3.3精密度 取2.2.3項下制備的對照品儲備液150 μL,置于20 mL量瓶中,用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度,搖勻；依次取上述溶液及2.2.1項下制備的衍生化溶液各0.5 mL,共同置于20 mL頂空瓶中,立即密封。

甲磺酸甲酯的峰面積之比的RSD值為0.9%,甲磺酸乙酯的峰面積之比的RSD值為1.3%。

2.3.4加樣回收率 分別取2.2.3項下制備的對照品儲備液120,150和180 μL,分別置于20,20和20 mL量瓶中,用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋至刻度,搖勻；依次取上述各溶液0.5 mL、2.2.1項下制備的衍生化溶液0.5 mL及樣品25 mg,共同置于20 mL頂空瓶中,壓蓋密封,制成含甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯分別為低、中、高質(zhì)量濃度的溶液各3份。

甲磺酸甲酯的平均回收率為102%,RSD值為2.9%；甲磺酸乙酯的平均回收率為106%,RSD值為1.2%,見表1～2。

表1甲磺酸甲酯加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.1 The results of recovery tests of mthylmesylate (n=9)

表2甲磺酸乙酯加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.2 The results of recovery tests of ethylmesylate (n=9)

2.4樣品測定 樣品中甲磺酸甲酯的含量為0.000 01%,甲磺酸乙酯的含量為0,甲磺酸酯的總含量為0.000 01%,見圖1。結(jié)果表明,甲磺酸酯的總含量符合規(guī)定(標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：甲磺酸酯總含量不得超過0.000 5%)。

圖1GC-MS圖

A.對照品；B.樣品；1.碘化甲烷；2.碘化乙烷3.碘化丁烷。

Fig.1 GC-MS chromatograms

A.reference substance；B.sample；1.methyl iodide；2.ethyl iodide；3.butane iodide.

3 小結(jié)

近年來,對各種原料藥中甲磺酸酯類雜質(zhì)檢測研究的較多,常用的方法包括氣相色譜法(GC-FID、GC-ECD)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)以及離子色譜等[6-12],筆者參考《歐洲藥典》(EP)8.0版附錄提出使用衍生化頂空GC-MS法測定甲磺酸酯類雜質(zhì)含量的方法,本實驗采用衍生化頂空GC-MS法,同時為了減少進(jìn)樣誤差等因素對檢測結(jié)果的影響,采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行樣品的測定,選擇待測物同系物甲磺酸丁酯為內(nèi)標(biāo)。

甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯和甲磺酸丁酯沸點較高,均大于200 ℃[13],無法對其進(jìn)行氣化測定,因此實驗采用柱前衍生化法,使甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸丁酯與碘離子作用分別轉(zhuǎn)化為碘代甲烷、碘代乙烷和碘代丁烷,沸點明顯降低,適用于氣相色譜法進(jìn)行測定。同時,通過柱前衍生化法將原先的鹽轉(zhuǎn)化為中性物質(zhì),增強(qiáng)其在色譜柱上的保留行為,改善峰形,提高了柱效和檢測靈敏度[14-17],有益于更好地控制甲磺酸萘莫司他中上述2種成分的含量。

直接進(jìn)樣法或頂空進(jìn)樣法均可測定甲磺酸酯類化合物的含量,但由于直接進(jìn)樣法操作簡便,會將大量其余物質(zhì)帶入系統(tǒng),增加系統(tǒng)污染風(fēng)險,而頂空進(jìn)樣法可有效控制污染,通過柱前衍生化法,將待測物及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為沸點降低的小分子物質(zhì),便于頂空進(jìn)樣的實施。

本次實驗通過上述方法測定,得到甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的線性范圍分別為3.0～200.0(r=0.997 5)和3.0～200.0 ng·mL-1(r=0.999 9)；檢測限分別為0.964 3 和1.007 8 ng·mL-1；定量限分別為2.892 8和3.022 3 ng·mL-1；進(jìn)樣精密度的RSD值分別為0.9%和1.3%；平均加樣回收率分別為102%(RSD=2.9%)和106%(RSD=1.2%)。

綜上所述,本實驗建立了柱前衍生化和GC-MS聯(lián)用的方法測定甲磺酸萘莫司他中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的含量,該方法簡單、靈敏度高、重復(fù)性好,可用于甲磺酸萘莫司他中甲磺酸酯類化合物的含量測定。

[1] 陸美貞.抗胰腺炎藥甲磺酸萘莫司他[J].國外藥學(xué)——合成藥、生化藥、制劑分冊,1988,9(4):234-235

[2] 李博,步芬,徐光富.甲磺酸萘莫司他中有機(jī)溶劑殘留的測定[J].中國醫(yī)藥科學(xué),2011,1(23):41-42.

[3] 陳寶泉,趙煜松,歐陽杰,等.甲磺酸萘莫司他的合成[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2007,38(8):545-546.

[4] Elder D P,Teasdale A,Lipczynski A M.Control and analysis of alkyl esters of alkyl and aryl sulfonic acids in novel active pharmaceutical ingredients (APIs).[J].J Pharm Biomed Anal,2008,(46):1-8.

[5] Bolt H M,Foth H,Hengstler J G,et al.Carcinogenicity categorization of chemicals-new aspects to be considered in a European perspective[J].Toxicol Lett,2004,(151):29-41.

[6] 毛頤晴,李緯,朱麗君,等.GC-MS法測定甲磺酸萘莫司他原料藥中的遺傳毒性雜質(zhì)[J].中國藥房,2016,27(18):2555-2557.

[7] 連小剛,李孝壁,程紅艷.衍生氣相色譜法測定甲磺酸伊馬替尼中甲磺酸烷基酯類[J].中國醫(yī)藥科學(xué),2013,3(17):128-130.

[8] 丁逸梅,吳娟,陸春曉,等.鹽酸決奈達(dá)隆中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的GC-MS法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2014,45(11):1069-1071.

[9] 馮慧敏,杭太俊,高新桃,等.LC-MS法同時檢測甲磺酸伊馬替尼中3個磺酸酯基因毒雜質(zhì)[J].藥物分析雜志,2014,34(12):2202-2206.

[10]劉立云,張倩如,孫連福,等.GC-MS法同時測定鹽酸決奈達(dá)隆中的3種甲磺酸酯[J].中國藥師,2014,17(8):1274-1276.

[11]孫營營,阮佳威,胡方劍,等.離子色譜法測定齊多夫定中甲磺酸甲酯的質(zhì)量濃度[J].浙江大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版,2015,42(1):116-119.

[12]張萌萌,潘紅娟,陳佳,等.鹽酸達(dá)泊西汀中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯及甲磺酸異丙酯的頂空毛細(xì)管GC-ECD法測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2015,46(1):55-58.

[13]劉立云,張倩茹,孫連福,等.GC-MS法同時測定鹽酸決奈達(dá)隆中的3種甲磺酸酯[J].中國藥師,2014,17(8):1274-1276.

[14]黃麗丹,邢亞東,王玲玲,等.2,4-二硝基氟苯柱前衍生化HPLC法測定保健食品中?；撬岷縖J].藥物分析雜志,2016,36(1):171-175.

[15]馮歡,李新霞,馮崴,等.柱前衍生化HPLC法測定不同產(chǎn)地胡蘆巴中4-羥基異亮氨酸的含量[J].西北藥學(xué)雜志,2016,31(2):136-138.

[16]欒維勵,朱樂亭,楊莉,等.柱前衍生化HPLC法測定人血漿丙戊酸濃度的研究進(jìn)展[J].中國藥房,2016,27(11):1577-1579.

[17]馬經(jīng)明,趙吉平.柱前衍生化HPLC法測定維U顛茄鋁膠囊中維生素U的含量[J].藥物分析雜志,2016,36(7):1293-1298.