清心安神桂仁茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

肖會(huì)敏,雷美娜,何 悅,劉 洋,王四旺

(空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所,西安 710032)

清心安神桂仁茶是由酸棗仁、茯苓、蓮子、龍眼肉和百合等藥食同源中藥組成的以清心安神為主要功效的袋泡茶劑。方中酸棗仁含有酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和黃酮類斯皮諾素等成分,其中黃酮類對(duì)中樞有抑制作用[1-3]；茯苓具有免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗氧化等作用[4-7]；蓮子具有免疫興奮、抗氧化等功效[8-10]；龍眼具有抗氧化等功效[11-13]；百合對(duì)腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂狀態(tài)有很好的改善作用[14-16]。本茶劑主要通過(guò)粉碎、混勻等工藝制成袋泡茶,為了控制茶劑質(zhì)量,本研究通過(guò)TLC法與HPLC法對(duì)清心安神桂仁茶中的有效成分進(jìn)行定量與定性研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Prominence UFLC型高效液相色譜儀,配LC-20AD雙泵,SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器(日本島津公司)；KQ5200DE數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山超聲儀器有限公司)；BSA124S電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2試藥 酸棗仁、茯苓和龍眼肉對(duì)照藥材以及斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B對(duì)照品,均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；清心安神桂仁茶(批號(hào)：20161208,20161209,20161210),由陜西含光生物科技有限公司研制并提供；甲醇、乙腈均為色譜純,美國(guó)Fisher公司；超純水,自制；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1斯皮諾素的TLC鑒別 取5袋本品,研細(xì)混勻,稱取粉末9 g,加石油醚(60～90 ℃)100 mL,加熱回流2次,每次2 h,濾過(guò),棄濾液,揮干藥渣,加甲醇100 mL加熱回流1 h,濾過(guò),蒸干濾液,殘?jiān)? mL甲醇使溶解,作為供試品溶液；依照處方比例制成缺酸棗仁的茶劑,同法制成酸棗仁陰性對(duì)照溶液；取1 g酸棗仁對(duì)照藥材,同法制成酸棗仁對(duì)照藥材溶液；另取斯皮諾素對(duì)照品,加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的斯皮諾素溶液,作為對(duì)照品溶液。依據(jù)文獻(xiàn)方法[17]進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別吸取上述不同的4種溶液各5 μL,點(diǎn)于同一硅膠G板上,展開劑為水飽和的正丁醇,展開,取出,晾干,噴質(zhì)量濃度為10 g·L-1的香草醛硫酸溶液作為顯色劑,于紫外光燈365 nm下檢視。結(jié)果顯示,供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,出現(xiàn)特征斑點(diǎn),陰性對(duì)照無(wú)干擾,見圖1A。

2.2酸棗仁皂苷A與酸棗仁皂苷B的TLC鑒別 取5袋本品,研細(xì)混勻,稱取粉末9 g,加石油醚(60～90 ℃)100 mL加熱回流2 h,2次,濾過(guò),棄去石油醚,藥渣揮干后加水200 mL,加熱回流30 min,濾過(guò),棄濾液,揮干藥渣,加甲醇100 mL超聲(250 W,100 kHz)1 h,濾過(guò),蒸干濾液,殘?jiān)蛹状? mL使溶解,作為供試品溶液；依照處方比例制成缺酸棗仁的茶劑,同法制成酸棗仁陰性對(duì)照溶液；取1 g酸棗仁對(duì)照藥材,同法制成酸棗仁對(duì)照藥材溶液；再取酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B加甲醇制成質(zhì)量濃度均為1 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。依據(jù)文獻(xiàn)方法[17]實(shí)驗(yàn),分別吸取上述不同的4種溶液各5 μL,點(diǎn)于同一硅膠G板上,展開劑為水飽和的正丁醇,展開,取出,晾干,噴質(zhì)量濃度為10 g·L-1的香草醛硫酸溶液作為顯色劑,加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示,供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,出現(xiàn)特征斑點(diǎn),陰性對(duì)照無(wú)干擾,見圖1B。

2.3茯苓的TLC鑒別 取5袋本品,研細(xì)混勻,稱取粉末7 g,加100 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇加熱回流4 h,濾過(guò),蒸干濾液,再加2 mL甲醇使溶解,作為供試品溶液；依處方比例制成缺茯苓的茶劑,同法制成茯苓陰性對(duì)照溶液；另取茯苓對(duì)照藥材1 g,加20 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇加熱回流4 h,濾過(guò),蒸干濾液,加2 mL甲醇制成對(duì)照藥材溶液。依據(jù)文獻(xiàn)方法[17]實(shí)驗(yàn),分別吸取上述3種不同的溶液各10 μL,點(diǎn)于同一硅膠G板上,使用展開劑為氯仿-乙酸乙酯-甲醇(10∶1∶0.2),展開,取出,晾干,噴以100 mL·L-1的硫酸乙醇液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示,供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,出現(xiàn)特征斑點(diǎn),陰性對(duì)照無(wú)干擾,見圖1C。

2.4龍眼肉的TLC鑒別 取5袋本品,研細(xì)混勻,稱取粉末7 g,加乙醇100 mL回流1 h,濾過(guò),蒸干濾液,加水20 mL使殘?jiān)芙?用乙酸乙酯萃取2次,每次20 mL,合并萃取液,用20 mL水洗滌,并將乙酸乙酯層濃縮至2 mL,作為供試品溶液。依照處方比例制成缺龍眼肉的茶劑,同法制成龍眼肉陰性對(duì)照溶液；取龍眼肉對(duì)照藥材1.5 g,按照2.5.3項(xiàng)下方法制成對(duì)照藥材溶液。依據(jù)文獻(xiàn)方法[17]實(shí)驗(yàn),分別吸取上述3種不同的溶液各5 μL,點(diǎn)于同一硅膠G板上,使用展開劑為氯仿-甲醇-甲酸(8∶1∶0.25),展開,取出,晾干,在紫外光燈365 nm下檢視。結(jié)果顯示,供試品在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,出現(xiàn)特征顯斑點(diǎn),陰性對(duì)照無(wú)干擾,見圖1D。

2.5斯皮諾素含量的測(cè)定

2.5.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A、水為流動(dòng)相B,0～10 min,B 88%→81%；10～16 min,B 81%→80%；16～22 min,B 80%→40%；22～30 min,B 40%→0%；記錄時(shí)間：30 min。流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm；進(jìn)樣量：20 μL。理論塔板數(shù)按照斯皮諾素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2.5.2對(duì)照品溶液的制備 取斯皮諾素對(duì)照品12.40 mg,置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度,搖勻,即得。

2.5.3供試品溶液的制備 取本品5袋,研細(xì)混勻,稱取粉末6 g,加石油醚(60～90 ℃)100 mL,置于250 mL錐形瓶中,加熱回流1 h,去除石油醚,藥渣蒸干,殘?jiān)?0 mL甲醇,加熱回流1 h,濾過(guò),收集并蒸干濾液,加甲醇使殘?jiān)芙?置于5 mL量瓶中,定容即得。

2.5.4酸棗仁陰性對(duì)照溶液的制備 按照處方比例及工藝制成缺酸棗仁的茶劑,按照2.5.3項(xiàng)下方法制備酸棗仁陰性對(duì)照溶液。

2.5.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密吸取質(zhì)量濃度為1.24 mg·mL-1的斯皮諾素對(duì)照品溶液0.005,0.010,0.030,0.050,0.200和1.000 mL,分別置于2 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,依次得到質(zhì)量濃度分別為3.10,6.20,18.60,31.00,124.00和620.00 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液,用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò),分別吸取各對(duì)照品溶液20 μL進(jìn)樣,按照2.5.3項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積,以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(y)、對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=429 563x-236 697,r=0.999 6。結(jié)果表明,斯皮諾素質(zhì)量濃度在3.10～620.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1TLC圖

A.斯皮諾素:1～2.清心安神桂仁茶；3～4.酸棗仁空白對(duì)照；5～6.酸棗仁對(duì)照藥材；7～8.斯皮諾素對(duì)照品。B.酸棗仁皂苷：1～2.清心安神桂仁茶；3.酸棗仁空白對(duì)照；4～5.酸棗仁對(duì)照藥材；6.酸棗仁皂苷A；7.酸棗仁皂苷B。C.茯苓：1～2.清心安神桂仁茶；3～4.茯苓空白對(duì)照；5～6.茯苓對(duì)照藥材。D.龍眼肉：1～2.清心安神桂仁茶；3～4.龍眼肉空白對(duì)照；5～6.龍眼肉對(duì)照藥材。

Fig.1 TLC chromatograms

A.spinosin:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3-4.blank control ofZizipphiSpinosaeSemen；5-6.reference crude herb ofZizipphiSpinosaeSemen；7-8.spinosin standard.B.jujuboside:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3.blank control ofZizipphiSpinosaeSemen；4-5.reference crude herb ofZizipphiSpinosaeSemen；6.jujuboside A;7.jujuboside B.C.Poriacocos:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3-4.blank control ofPoriacocos；5-6.reference crude herb ofPoriacocos.D.DriedLonganPulp:1-2.Qingxin′anshenguiren Tea；3-4.blank control ofDriedLonganPulp；5-6.reference crude herb ofDriedLonganPulp.

2.5.6專屬性實(shí)驗(yàn) 取斯皮諾素對(duì)照品溶液、供試品溶液和酸棗仁陰性對(duì)照溶液各20 μL,按照2.5.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見圖2,陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果表明,該方法專屬性強(qiáng)。

圖2HPLC圖

A.斯皮諾素對(duì)照品；B.樣品；C.陰性樣品(缺酸棗仁)；1.斯皮諾素。

Fig.5 HPLC chromatograms

A.spinosin reference substance；B.sample；C.negative control (missing spina date seed)；1.spinosin.

2.5.7精密度實(shí)驗(yàn) 取斯皮諾素對(duì)照品溶液(精密量取質(zhì)量濃度為1.24 mg·mL-1的線性樣品溶液0.030 mL,加甲醇定容至2 mL,即得質(zhì)量濃度為18.60 μg·mL-1的對(duì)照品溶液),連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)定峰面積RSD值為1.94%。結(jié)果表明,該儀器精密度良好。

2.5.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為18.60 μg·mL-1的斯皮諾素對(duì)照品溶液,在第0,1,2,4,8和12 h進(jìn)樣,測(cè)定峰面積RSD值為1.97%。結(jié)果表明,12 h內(nèi)該樣品穩(wěn)定。

2.5.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取樣品(批號(hào)20161208)5份,按照2.5.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.5.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果茶劑中斯皮諾素的含量為88.40 μg·g-1,RSD值為1.90%。

2.5.10回收率實(shí)驗(yàn) 取3袋本品(批號(hào)20161208),研細(xì)混勻,稱取粉末6 g(斯皮諾素的含量為88.40 μg·g-1),加石油醚(60～90 ℃)100 mL,置于250 mL錐形瓶中,添加對(duì)照品溶液,稱取斯皮諾素10 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,按照2.5.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.5.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見表1。由表1可知,平均加樣回收率為96.07%,RSD值為1.39%。結(jié)果表明,該方法加樣回收率良好。

表1斯皮諾素加樣回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Results of the recovery test of spinosin

取樣量/g相當(dāng)于斯皮諾素的量/mg添加斯皮諾素的量/mg測(cè)出斯皮諾素總量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%2.28910.20240.140.336896.000096.071.392.15240.19030.160.340293.68752.67480.23650.190.421897.52633.19670.28260.230.501495.13043.22600.28520.230.508797.17392.65630.23480.190.418996.8947

2.5.11樣品測(cè)定 按照2.5.3項(xiàng)下方法進(jìn)行制備,按照2.5.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,按照外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果顯示,3批樣品中斯皮諾素的平均含量為90.60 μg·g-1,RSD值為1.34%。結(jié)果表明,不同批次間均一性較好。

3 討論

3.1TLC鑒別 依據(jù)文獻(xiàn)方法[18],對(duì)茶劑中酸棗仁藥材及其中的斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和茯苓藥材進(jìn)行鑒別,結(jié)果可檢出清晰的特征斑點(diǎn),Rf適中,重復(fù)性較好,專屬性強(qiáng),故列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)文獻(xiàn)方法[19],對(duì)茶劑中的龍眼肉進(jìn)行鑒別,可檢出特征斑點(diǎn),同時(shí)具有重復(fù)性與專屬性,故列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)文獻(xiàn)方法[7],對(duì)茶劑中百合、蓮子進(jìn)行鑒別,出現(xiàn)清晰斑點(diǎn),陰性對(duì)照有干擾,無(wú)專屬性,故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2含量測(cè)定 依據(jù)文獻(xiàn)方法[18],對(duì)制樣方法進(jìn)行篩選,篩選方法1：第一步,用石油醚回流4 h；第二步,①用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流2 h,或②用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇(0,50%,70%和80%)超聲30 min或③用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇(50%,70%和80%)超聲30 min或④乙腈超聲30 min。篩選方法2：水提醇沉法,檢測(cè)結(jié)果均不理想,后采用先用石油醚回流1 h,再用甲醇回流1 h的方法,結(jié)果顯示,目標(biāo)峰分離度大于1.5,陰性對(duì)照無(wú)干擾。經(jīng)方法學(xué)考察,各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。

綜上所述,把具有良好穩(wěn)定性與重復(fù)性的含量測(cè)定項(xiàng)及專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好的TLC鑒別(即斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B成分以及茯苓、龍眼肉藥材)進(jìn)行鑒別,納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),可以很好地控制茶劑的質(zhì)量。

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