基于光干涉技術(shù)的葉片表面微結(jié)構(gòu)特征獲取與表征

李青林， 王錦濤

(江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

葉片作為植物的營養(yǎng)器官，其細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化一直被認(rèn)為是作物生理狀態(tài)變化的重要指標(biāo)[1-2]。近年來，研究人員開始關(guān)注植物葉片表面微結(jié)構(gòu)與作物生理狀態(tài)之間關(guān)系的研究，并取得了很大進(jìn)展。Franks等研究了不同養(yǎng)分條件下葉片表面結(jié)構(gòu)的變化[3-7]；Kalicharan等研究了香茶菜表面絨毛的分布、形態(tài)及其隨時(shí)間的化學(xué)特征的變化[8]。

現(xiàn)有表面微結(jié)構(gòu)的測量方法主要有掃描電鏡方法、原子力顯微鏡方法。掃描電鏡方法在植物葉片表面形貌觀察方面的應(yīng)用最為廣泛，能得到分辨率高的表面形貌圖，但是需要對樣本進(jìn)行復(fù)雜的前處理，用時(shí)較長，而且對結(jié)構(gòu)參數(shù)的度量需要借助別的軟件才能完成；原子力顯微鏡方法是借助探針對被測量表面進(jìn)行接觸測量，因?yàn)橹参锶~片表面是由細(xì)胞組成的，極易被損壞，所以該方法不適于葉片表面的測量。因此，研究人員進(jìn)行了用于植物表面快速測量方法的探索。

Kim等借助白光干涉技術(shù)對松樹葉表面進(jìn)行了觀察，并進(jìn)行了葉片表面輪廓的定量表征[9]；Kim等利用白光干涉技術(shù)對紅楠樹葉表面的研究發(fā)現(xiàn)，葉片表面分布著顆粒狀、角狀突起物[10]；張艷借助白光干涉方法研究了透明膜表面三維輪廓變化情況，可以得到表面的三維輪廓，并同時(shí)測量出透明薄膜的三維形態(tài)信息和厚度[11]。

本研究旨在借助白光干涉方法，獲取植物葉片表面幾何特征，并根據(jù)其幾何形態(tài)特征選擇合適的參數(shù)對其進(jìn)行表征。

1 測量原理

光干涉測量是一種利用光干涉原理測量光程差，從而測定被測對象表面微結(jié)構(gòu)的方法[12]。如圖1所示，光源發(fā)出的光經(jīng)分光鏡后分成2束，其中1束為參考光線，另1束經(jīng)被測表面反射。根據(jù)2束光線的光程差，從而得到被測表面的結(jié)構(gòu)，并可以進(jìn)行測量表達(dá)。

2 微結(jié)構(gòu)特征獲取方法

由于植物組織具有較柔軟的特殊性，不能保證和金屬樣本一樣緊貼在載物臺表面，因此本研究中采用載玻片的方法，將葉片樣本放在載玻片上之后，置于載物臺上(圖2)。從固定液中取出植物葉片樣本后，立刻置于25.4 mm×76.2 mm的載玻片上，葉片正面朝下，背面朝上，并使葉片緊貼載玻片，以保證葉肉樣本處于水平狀態(tài)。

調(diào)整物鏡和載物臺之間的距離(Z向，即垂直方向)使圖像聚焦，根據(jù)測量對象的不同，選擇合適的采集范圍。因?yàn)槿~片表面絨毛高度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于氣孔、葉肉細(xì)胞以及維管束的高度，所以在觀察時(shí)，需要調(diào)整鏡頭Z向的距離。觀察氣孔、葉肉細(xì)胞以及維管束時(shí)，采集的高度最高為20 μm，用精細(xì)采集模式進(jìn)行采集；需要觀察絨毛時(shí)，重新進(jìn)行聚焦成像，此時(shí)設(shè)置采集的高度最高為200 μm，用精細(xì)采集模式進(jìn)行采集。

在顯微系統(tǒng)下觀察葉片表面氣孔、葉肉細(xì)胞、維管束和絨毛的幾何特征，分別進(jìn)行二維、三維成像，選取典型視野拍照。每個(gè)樣本至少觀察統(tǒng)計(jì)10個(gè)視野，取平均值。本研究中所有的測量數(shù)據(jù)均由測量系統(tǒng)自帶軟件測量并計(jì)算完成。

3 結(jié)果與分析

3.1 氣孔的形態(tài)參數(shù)

氣孔是由保衛(wèi)細(xì)胞之間形成的凸透鏡狀的小孔，與其下細(xì)胞間隙(氣室)相連，在呼吸、蒸騰作用中，是空氣和水蒸氣的通路，具有重要的生理意義。葉片表面的氣孔數(shù)量和形態(tài)直接影響作物的生理狀態(tài)，因此需要表征氣孔的形態(tài)參數(shù)，從而確定它們對作物生理狀態(tài)的影響。圖3為葉片表面的氣孔分布情況。

為了滿足氣孔形態(tài)參數(shù)能表達(dá)作物生理狀態(tài)的要求，本研究選擇氣孔分布密度、氣孔的形態(tài)參數(shù)作為特征參數(shù)。用計(jì)數(shù)方法計(jì)量單位面積內(nèi)氣孔的數(shù)量；用幾何測量方法來測量氣孔的大??；用高度測量、剖面測量和面積測量方法來綜合表征氣孔的形態(tài)特征，在葉肉大小為20 μm×20 μm的條件下，氣孔測量結(jié)果如下：氣孔直徑(15.23±3.35) μm，氣孔體積(33 889±249)μm3，氣孔表面積(3 778.033±80.748)μm2，氣孔密度(1 310.75±23.47)個(gè)/mm2。

3.2 葉肉表皮細(xì)胞的形態(tài)參數(shù)

葉肉表皮細(xì)胞是葉片表面分布最豐富的細(xì)胞，由圖4可以看出，葉肉表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)出一定的凸凹狀，雖然生長狀態(tài)下表皮細(xì)胞呈充盈狀態(tài)，但當(dāng)作物受到某種方式的脅迫時(shí)，表皮細(xì)胞形態(tài)會發(fā)生變化，所以需要評價(jià)葉肉表皮細(xì)胞的形態(tài)。植物表皮細(xì)胞一般按一定的方式緊密排列在一起，從而組成葉片表皮，且細(xì)胞形態(tài)相似，因此本研究對指定 20 μm×20 μm 區(qū)域葉肉表皮細(xì)胞的體積、表面積以及細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測量，相應(yīng)的葉肉表皮細(xì)胞形態(tài)參數(shù)如下：體積(33 889±249)μm3，表面積(3 778.033±80.748)μm2，細(xì)胞數(shù)(53.1±2.7)個(gè)。

3.3 維管束的形態(tài)參數(shù)

葉片表面分布著豐富的維管束，維管束相互連接構(gòu)成微管系統(tǒng)，輸導(dǎo)來自根部的水分、無機(jī)鹽和養(yǎng)分[13-14]，因此其密度、形態(tài)對作物的生理狀態(tài)有一定的指針作用。圖5是維管束分布示意，可見葉片表面維管束分布具有一定的規(guī)律性，但維管束直徑因其分布位置的不同而存在較大差異，為了充分表達(dá)維管束分布和幾何形態(tài)，本研究選擇幾何測量、剖面測量和體積測量的方法來表征維管束的形態(tài)參數(shù)，在葉面積200 μm×200 μm 的條件下，維管束各參數(shù)如下：直徑(36.23±4.65)μm，面積占葉面積40.3%，總體積(262 219±2 345)μm3。

3.4 絨毛的形態(tài)參數(shù)

葉片表面分布著絨毛，最新的研究表明，絨毛在作物的代謝方面有著重要的作用，從而影響作物的生理過程。為了實(shí)現(xiàn)用絨毛參數(shù)充分反映作物的生理狀態(tài)，本研究重點(diǎn)分析絨毛分布和絨毛形態(tài)。從圖6可以看出，絨毛高度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于周圍其他組織，因此用絨毛密度、高度和體積參數(shù)來表征其形態(tài)，在葉面積40 μm×40 μm的條件下，絨毛各參數(shù)如下：絨毛高度(195.245±10.245)μm，單根絨毛體積(202 772±574)μm3，絨毛密度(21.87±2.50)根/mm2。

4 討論

光干涉技術(shù)可以快速獲得葉片表面微結(jié)構(gòu)形態(tài)，無須對樣本進(jìn)行復(fù)雜的前處理。用該方法得到的圖片能反映葉片表面微結(jié)構(gòu)，并且能在測量系統(tǒng)自帶軟件中實(shí)現(xiàn)微結(jié)構(gòu)形態(tài)參數(shù)的測量。

根據(jù)葉片表面微結(jié)構(gòu)并結(jié)合作物的生理代謝過程，本研究選擇了葉片表面氣孔分布和形態(tài)、維管束分布和直徑、葉肉表皮細(xì)胞形態(tài)、絨毛分布密度、絨毛高度和體積作為葉片表面微結(jié)構(gòu)特征的表征參數(shù)，從而為基于葉片表面微結(jié)構(gòu)進(jìn)行作物生長信息模型的建立提供了依據(jù)。

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