木瓜蛋白酶復(fù)合劑抑制淮山酶促褐變的應(yīng)用

謝冬娣， 李丹梅， 龔振維

(賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣西賀州 542899)

鮮切果蔬保持了果蔬原有的新鮮狀態(tài)，又經(jīng)過了加工而使產(chǎn)品清潔衛(wèi)生，是滿足現(xiàn)代都市人快速生活節(jié)奏的一種果蔬加工方式?；瓷?Yam)為薯蕷科薯蕷屬薯蕷的根莖，別稱懷山藥、淮山藥，是藥食同源的蔬菜。鮮切淮山在加工和貯藏中極易產(chǎn)生褐變，嚴(yán)重影響其外觀，不利于銷售。目前對鮮切淮山褐變的控制主要采用物理方法[1-4]，也常使用化學(xué)護(hù)色方法[5-7]，但有一定局限性，極少有使用生物酶法的報(bào)道。由于木瓜蛋白酶已經(jīng)被證實(shí)對抑制酶促褐變有顯著效果[6-8]，但目前卻尚未有將其用于抑制鮮切淮山褐變的研究。筆者將木瓜蛋白酶結(jié)合抗壞血酸(AA)、氯化鈉(NaCl)以及檸檬酸(CA)，以單一抑制劑對淮山褐變控制效果的研究為基礎(chǔ)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化，研究安全環(huán)保的木瓜蛋白酶復(fù)合抑制劑對鮮切淮山酶促褐變的影響，以期探索生物酶法在淮山鮮切加工中的應(yīng)用，為鮮切淮山加工貯藏生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及主要藥品

主要材料：賀街淮山，為國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品；保鮮袋；木瓜蛋白酶 (酶活性100萬U)?？箟难帷⒙然c、檸檬酸、鄰苯二酚、H2O2、愈創(chuàng)木酚，以上藥品均為分析純。

1.2 試驗(yàn)處理方法

挑選外皮完好、無病害、無機(jī)械損傷的淮山，切成厚度為3～4 mm的斜片[2]，然后用不同濃度的抑制劑浸泡處理1 h，晾干表面處理液后，平鋪裝入保鮮袋中，置于5 ℃冷藏庫貯藏?？箟难釢舛仍O(shè)為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。氯化鈉濃度設(shè)為0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%。檸檬酸濃度設(shè)為0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%。木瓜蛋白酶濃度設(shè)為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。設(shè)不浸泡處理為對照組。試驗(yàn)觀察貯藏期5 d，第5天檢測淮山的多酚氧化酶(PPO)活性、過氧化物酶(POD)活性、褐變度(BD)等指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)3個重復(fù)。

在單一抑制劑單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，篩選出抑制褐變效果明顯的3個因素及其濃度水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定各種抑制劑與木瓜蛋白酶的最佳組合。正交試驗(yàn)各因素濃度水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 各因素濃度水平

1.3 指標(biāo)檢測方法

褐變度的測定：采用吸光度法，將樣品直接打碎，取適量樣品按體積比1 ∶10添加蒸餾水，低溫下勻漿2 min，過濾后取濾液于25 ℃保溫5 min，在波長410 nm處測定其吸光度，重復(fù)3次，以D410 nm×10表示褐變度。褐變度越高，表示褐變越嚴(yán)重。

多酚氧化酶活性測定：采用鄰苯二酚法[9]，以 1 min 內(nèi)吸光度變化0.01為1個酶活性單位，單位U/mL。過氧化物酶活性測定：采用愈創(chuàng)木酚法[9]，以1 min內(nèi)吸光度變化0.01為1個酶活性單位，U/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸抑制鮮切淮山酶促褐變效果

2.1.1 檸檬酸處理對淮山褐變度的影響 圖1顯示，在5 ℃的冷藏條件下，鮮切淮山經(jīng)過不同濃度檸檬酸處理，其褐變度BD值均低于對照組。其中，在0.25%～0.40%檸檬酸濃度范圍內(nèi)，隨著檸檬酸濃度增大，淮山的BD值一直呈現(xiàn)下降趨勢；檸檬酸濃度為0.40%時(shí)的BD值最低，與對照組差異最大；而在檸檬酸濃度為0.45%時(shí)淮山的BD值較高，但仍低于對照組。結(jié)果表明，檸檬酸處理濃度在0.40%時(shí)，對鮮切淮山的褐變抑制效果較好。

2.1.2 檸檬酸處理對淮山PPO、POD活性的影響 圖2顯示，鮮切淮山經(jīng)過不同濃度檸檬酸處理，其多酚氧化酶活性均明顯比對照組低，即表明檸檬酸能抑制鮮切淮山的PPO活性。原因可能是檸檬酸處理既調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，又對PPO的輔基起到螯合作用[6]，從而抑制PPO活性。當(dāng)檸檬酸濃度為0.30%～0.45%時(shí)，各處理組淮山PPO活性差異不明顯，其中0.35%濃度處理的淮山PPO活性最低，與0.25%濃度處理的差異較大。表明濃度為0.35%的檸檬酸抑制PPO活性效果比較明顯。圖2也顯示，在檸檬酸濃度試驗(yàn)范圍內(nèi)，各處理組淮山的多酚氧化物酶活性均比對照組低，但不明顯；各處理組淮山POD活性差異也不明顯，即表明檸檬酸能較好地抑制鮮切淮山的PPO活性，但不能很好地抑制鮮切淮山的POD活性，這類似于李紅濤等研究的檸檬酸不能有效抑制淮山貯藏期間POD活性的結(jié)果[7]。

2.2 抗壞血酸抑制鮮切淮山酶促褐變效果

2.2.1 抗壞血酸處理對淮山褐變度的影響 從圖3可以看出，鮮切淮山經(jīng)不同濃度抗壞血酸處理，除濃度為0.3%的處理外，其余濃度的抗壞血酸溶液處理的淮山的褐變度(BD值)均比對照組的低。原因可能是因?yàn)榭箟难嶙鳛轷€原劑，阻止醌類物質(zhì)進(jìn)一步自發(fā)聚合形成色素物質(zhì)[6]。其中，濃度為 0.10%、0.15%、0.20%抗壞血酸處理的BD值差異不明顯，而0.25%抗壞血酸處理的淮山的BD值最低，與對照組、0.30%處理組差異明顯，說明0.25%抗壞血酸對淮山褐變抑制效果較好。

2.2.2 抗壞血酸處理對淮山PPO、POD活性的影響 從圖4可以看出，不同濃度的抗壞血酸處理的鮮切淮山POD活性均比對照組的低。從0.10%濃度處理開始逐漸下降，到0.20%濃度處理降到最低點(diǎn)，之后，隨著抗壞血酸處理濃度的升高，淮山的POD活性逐漸升高。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，淮山POD活性隨著AA濃度增加而降低，之后隨著濃度增加而升高。其中0.20%抗壞血酸溶液對淮山POD活性抑制效果較好。經(jīng)過抗壞血酸處理的淮山的PPO活性也都比對照組的低，但是波動較大，在0.15%、0.20%濃度處理時(shí)分別達(dá)到最低、最高的PPO活性。這可能是由于抗壞血酸雖有金屬螯合作用，但是同時(shí)抗壞血酸也具有還原性、氧化性，能將氧化的醌還原為酚類物質(zhì)而抑制褐變，但其本身比酚類物質(zhì)更易于氧化褐變[7]。

2.3 木瓜蛋白酶抑制鮮切淮山酶促褐變效果

2.3.1 木瓜蛋白酶處理對淮山褐變度的影響 蛋白酶可導(dǎo)致一些促進(jìn)褐變的酶系失活，從而抑制褐變的發(fā)生[6]。從圖5可以看出，經(jīng)不同濃度木瓜蛋白酶處理的淮山的BD值大部分比對照組的低，表明木瓜蛋白酶對于控制淮山的褐變度有一定的效果，但是在低濃度時(shí)效果不明顯，其中0.20%濃度的木瓜蛋白酶抑制淮山褐變的效果最明顯。

2.3.2 木瓜蛋白酶處理對淮山PPO、POD活性的影響 從圖6可以看出，經(jīng)過不同濃度木瓜蛋白酶處理的鮮切淮山的PPO、POD活性均比對照組的低。原因可能是由于木瓜蛋白酶與醌類物質(zhì)偶聯(lián)中斷醌聚合，或與PPO、POD的輔基螯合而抑制了酶的活性[6]。在處理濃度0.10%～0.25%范圍內(nèi)，PPO、POD活性隨木瓜蛋白酶濃度增大而降低；在處理濃度在大于 0.25% 之后有升高的趨勢。結(jié)果表明，0.25%木瓜蛋白酶濃度處理對淮山PPO、POD活性的抑制效果較好。

2.4 氯化鈉抑制鮮切淮山酶促褐變效果

2.4.1 NaCl處理對淮山褐變度的影響 由圖7可以看出，在處理濃度0.5%～0.8%范圍內(nèi)，經(jīng)NaCl處理的鮮切淮山的BD值隨著NaCl溶液濃度的增加而逐漸升高，且大部分都高于對照組，表明NaCl溶液不能很好地保持淮山的感官特質(zhì)，而且隨著濃度的增加，效果越來越差。

2.4.2 NaCl處理對淮山PPO、POD活性的影響 NaCl可以通過降低果蔬表面的氧溶解度而抑制PPO的氧化作用，亦或是使褐變酶發(fā)生鹽析作用，從而抑制褐變[1]。由圖8可以看出，經(jīng)過不同濃度NaCl處理的鮮切淮山的PPO活性基本上比對照組的低，在NaCl處理濃度為0.5%～0.8%范圍內(nèi)，鮮切淮山POD活性均比對照組的低，但差異均不明顯，其中 0.5% 濃度NaCl處理的淮山PPO活性最高，并且達(dá)到對照組水平；隨著處理濃度的升高，淮山PPO活性逐漸下降，但是下降緩慢。0.4%濃度處理的淮山POD活性最高，超過對照組水平。試驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl溶液對鮮切淮山的PPO、POD活性有一定的抑制作用，但是效果均不明顯。

2.5 復(fù)合因素處理抑制鮮切淮山褐變的結(jié)果與分析

根據(jù)“2.1”至“2.4”節(jié)的結(jié)果分析，檸檬酸、抗壞血酸和木瓜蛋白酶單一處理的鮮切淮山各項(xiàng)指標(biāo)都比對照組的好，表明其抑制鮮切淮山褐變的效果比較好；而經(jīng)過NaCl溶液處理的鮮切淮山各項(xiàng)指標(biāo)與對照組很接近，有些比對照組差。因此選擇檸檬酸、抗壞血酸和木瓜蛋白酶作為正交試驗(yàn)的因素。

根據(jù)圖1至圖8的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，由于引起淮山褐變的酶主要是PPO，所以在用褐變抑制劑處理鮮切淮山時(shí)，以PPO活性作為首要指標(biāo)來判斷各濃度抑制劑防褐變效果的強(qiáng)弱，以其他2項(xiàng)指標(biāo)作為輔助指標(biāo)，每個因素選擇3個濃度水平(表1)進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)的結(jié)果與分析分別見表2、表3。

從表3可以看出，在BD值、PPO活性、POD活性方面，A是主要因素；在BD值、PPO活性方面，C是次主要因素，B是次要因素；在POD活性方面，B是次主要因素，C是次要因素。綜合考慮可知，3個因素對3個指標(biāo)影響的主次順序?yàn)锳﹥C﹥B。因素A、因素C的水平按“少數(shù)服從多數(shù)”原則分別選擇A3、C2。因素B對3個指標(biāo)的影響水平各不相同，難以選擇。因此，對組合A3B1C2、A3B2C2、A3B3C2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證結(jié)果中，A3B2C2組合(檸檬酸濃度0.40%、抗壞血酸濃度0.20%、木瓜蛋白酶濃度0.20%)最優(yōu)，獲得BD值0.194、PPO活性0.21 U/mL、POD活性9.2 U/mL的抑制褐變效果。

表2 復(fù)合抑制劑正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 復(fù)合抑制劑正交試驗(yàn)結(jié)果分析

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)遵循降低酸度、金屬螯合作用、醌還原作用、醌偶聯(lián)作用等褐變控制機(jī)制，探討冷藏(5 ℃)條件下鮮切淮山酶促褐變的控制措施。有關(guān)研究表明，鮮切果蔬的褐變主要是酶促褐變，大多認(rèn)為與酚類物質(zhì)含量和PPO活性密不可分[1，10-11]，淮山多酚氧化酶的最適pH值=6.0[12]，那么降低介質(zhì)中的pH值，可以控制酚酶的活性，抑制其催化作用。通常通過添加酸控制pH值使酚酶的活性喪失[6]。PPO、POD都是以金屬離子作為輔基的一種蛋白質(zhì)，它能被金屬鰲合物所抑制。檸檬酸是良好的酸化劑，除了通過調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值來抑制褐變外，其結(jié)構(gòu)中的3個羧基還可以對金屬離子起到較強(qiáng)的螯合作用[6]。而抗壞血酸既有金屬螯合作用，也可作為醌還原劑，從而清除自由基和活性氧，將氧化的醌還原為酚類物質(zhì)[3]。木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白酶，活性中心含半胱氨酸，可以作為醌類偶聯(lián)劑，能與醌類物質(zhì)形成無色的復(fù)合物，從而中斷醌類物質(zhì)聚合形成色素物質(zhì)；同時(shí)木瓜蛋白酶可以通過與PPO、POD活性位點(diǎn)的金屬離子不可逆結(jié)合而抑制褐變相關(guān)酶的活性[6]。為了達(dá)到良好防褐變效果，單一抑制劑長期使用或者高濃度使用會帶來成本高、危害健康等問題。因此，多種抑制劑復(fù)合使用可起到協(xié)同增效作用，既可以避免以上問題，也可成為鮮切淮山加工及貯藏過程中的防褐控制方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，鮮切淮山極易褐變，與相關(guān)報(bào)道有相同的結(jié)論。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用檸檬酸或抗壞血酸處理鮮切淮山時(shí)，在PPO活性、POD活性這2個指標(biāo)中，不同濃度影響酶活性強(qiáng)弱的順序差別較大。這可能是由于抗壞血酸雖然是一種PPO活性抑制劑，但作為抗氧化劑，它比酚類物質(zhì)更易氧化褐變，故不宜單獨(dú)用于防止淮山褐變；而檸檬酸、植酸、氯化鈣等復(fù)合劑僅對PPO活性有抑制作用，在鮮切淮山貯藏期間還會使POD活性有所提高[7]。

綜上試驗(yàn)結(jié)果表明，檸檬酸、抗壞血酸和木瓜蛋白酶抑制鮮切淮山的褐變具有較好的效果，而NaCl溶液對于防止鮮切淮山的褐變效果不明顯；采用檸檬酸、抗壞血酸和木瓜蛋白酶進(jìn)行正交試驗(yàn)所篩選的最佳抑制劑組合為0.40%檸檬酸+0.20%木瓜蛋白酶+0.20%抗壞血酸，各抑制劑作用主次順序?yàn)闄幟仕?木瓜蛋白酶>抗壞血酸。本試驗(yàn)將木瓜蛋白酶用于鮮切淮山褐變控制是首例，其效果接近檸檬酸和抗壞血酸，優(yōu)于氯化鈉，說明其效果較好，值得推廣。

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