蒙藥達(dá)烏里芯芭組織培養(yǎng)快速繁育技術(shù)

韋坤華， 李旻輝， 徐建平， 朱 虹， 李林軒， 繆劍華， 高文遠(yuǎn)

(1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072； 2.廣西藥用植物園/廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530023；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

達(dá)烏里芯芭(CymbariadahuricaL.)為玄參科芯芭屬植物，別稱大黃花、白蒿茶，是蒙醫(yī)專用藥芯芭的基源植物，蒙名為興安奈―哈吞―額布斯，達(dá)烏里芯芭屬于軸根型旱生植物，常生長于荒漠草原和山地草原，是草原上的主要植被，主要分布于內(nèi)蒙古、黑龍江、河北等地。達(dá)烏里芯芭全株入藥，蒙藥名為韓琴色日高[1]，味微苦，性涼，具有祛風(fēng)除濕、活血調(diào)經(jīng)、散瘀止痛的功效，用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、吐血、衄血、便血、外傷出血、腎炎水腫、黃水瘡等癥[2-3]。

目前，市場(chǎng)上的芯芭藥材主要來自野生資源，隨著其藥用價(jià)值的提高，市場(chǎng)對(duì)藥材的需求增大，導(dǎo)致達(dá)烏里芯芭被過渡采挖，野生資源蘊(yùn)藏量也日趨減少，資源瀕臨枯竭。雖然近年來國內(nèi)外對(duì)蒙藥的關(guān)注不斷增加，蒙藥芯芭也引起了諸多學(xué)者的重視，研究報(bào)道不斷增加，但主要集中在資源分布、定性鑒別、化學(xué)成分及藥理作用研究上[4-8]。到目前為止，針對(duì)芯芭的人工種植、種苗繁育技術(shù)的相關(guān)研究未見報(bào)道。達(dá)烏里芯芭一般通過種子進(jìn)行繁殖，但在初步的種苗繁育工作中發(fā)現(xiàn)，達(dá)烏里芯芭的種子繁殖存在發(fā)芽率低、發(fā)芽不整齊、種苗質(zhì)量不穩(wěn)定等問題，嚴(yán)重制約了達(dá)烏里芯芭的規(guī)范化種植和生產(chǎn)。本研究以蒙藥芯芭的基源植物達(dá)烏里芯芭的種子為材料進(jìn)行無菌苗的誘導(dǎo)，再通過正交試驗(yàn)篩選最適合達(dá)烏里芯芭叢生芽快速繁殖與生根培養(yǎng)基，為達(dá)烏里芯芭種苗的快速繁殖和工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

達(dá)烏里芯芭種子采于內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市石拐區(qū)趙長城遺址附近山地，經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張春紅副教授鑒定該品種為達(dá)烏里芯芭CymbariadahuriaL.，經(jīng)篩選后選用飽滿成熟的種子作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件 本試驗(yàn)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加0.4%瓊脂，3.0%蔗糖，pH值調(diào)至5.8～6.0，在121 ℃的溫度下滅菌20 min，平均照度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度(25±3)℃。

2.2 外植體消毒

取飽滿的達(dá)烏里芯芭成熟種子，使用洗潔精溶液清洗干凈，洗凈洗潔精后置于紗布中，珠狀流水下沖洗15 min。在超凈工作臺(tái)上，用濾紙吸干水分后，加入0.1%HgCl2溶液消毒，設(shè)置6、8、10、12 min等4個(gè)時(shí)間梯度，消毒完畢后，棄去HgCl2溶液，用無菌水漂洗種子3次，再用無菌濾紙吸干水分，接種到初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

2.3 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)及初步增殖

將消毒好的種子設(shè)去種皮和不去種皮2種處理，接種到添加了1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA的MS初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25～30 d誘導(dǎo)種子萌發(fā)。每種處理接種10瓶，每瓶接種2顆種子。

種子萌發(fā)后，將無菌萌發(fā)小苗頂芽切下繼續(xù)接種到添加了1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行初步增殖，30 d轉(zhuǎn)接1次，繼代培養(yǎng)4～5代后獲得充足的試驗(yàn)材料。

2.4 叢生芽增殖培養(yǎng)

采用3因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)(表1)，將初步增殖材料接種到分別添加了6-BA、IAA、KT等3種激素的3個(gè)水平的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每個(gè)處理5瓶，每瓶接種5個(gè)芽，選取的芽大小長勢(shì)接近，30 d后測(cè)定試管苗平均生長率和芽增殖系數(shù)，并同時(shí)觀察記錄生長情況。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.5 生根培養(yǎng)

將增殖的健壯叢生芽接種到分別添加不同濃度的NAA(0.1、0.5、1.0 mg/L)、IAA(0.1、0.5、1.0 mg/L)的1/2MS生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，每個(gè)處理5瓶，每瓶3個(gè)單芽，30 d 后觀察并記錄生根情況，計(jì)算試管苗生根率。

2.6 數(shù)據(jù)處理

培養(yǎng)30 d后計(jì)算平均生長率、芽增殖系數(shù)和生根率。平均生長率=(材料質(zhì)量-接種時(shí)材料質(zhì)量)/接種時(shí)材料質(zhì)量；平均芽增殖系數(shù)=(增殖后芽數(shù)-接種時(shí)材料數(shù))/接種時(shí)材料數(shù)；生根率=增殖后生根芽數(shù)/接種時(shí)芽數(shù)。將所有生根苗生長狀況按大小分成5級(jí)，分別記為“+++++”“++++”“+++”“++”“+”。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同的處理方法對(duì)種子萌發(fā)的影響

由表2可見，HgCl2消毒時(shí)間越長，消毒效果越好，污染率越低，不去皮和去處2種處理種子滅菌時(shí)間從6 min延長到12 mim時(shí)，污染率分別從75%和50%下降到30%和25%。但HgCl2消毒時(shí)間過長，易導(dǎo)致種子損傷甚至死亡。2組試驗(yàn)的種子消毒 6 min 時(shí)萌發(fā)率分別為60%和70%，當(dāng)消毒時(shí)間延長到 12 min 時(shí)的萌發(fā)率分別為30%和35%。結(jié)果也表明很多沒有完全消毒的種子也能萌發(fā)，消毒時(shí)間為6 min時(shí)，2種處理種子無菌萌發(fā)率分別為15%和30%，分別占本組萌發(fā)種子的25%與43%。綜合考慮消毒時(shí)間對(duì)種子的影響以及種子消毒效果，確定達(dá)烏里芯芭的消毒時(shí)間為8 min。

比較消毒后采取不同處理的2組種子的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)去種皮處理組的污染率較不去種皮低，此外去種皮處理可提高種子的萌發(fā)率和無菌萌發(fā)率。因此，消毒后進(jìn)行剝?nèi)シN皮處理可提高達(dá)烏里芯芭的種子消毒效果。

表2 不同處理對(duì)達(dá)烏里芯芭外植體滅菌效果的比較

3.2 不同激素配比對(duì)達(dá)烏里芯芭叢生芽增殖率的影響

將達(dá)烏里芯芭的無菌芽接種到表1正交試驗(yàn)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后測(cè)定平均生長率、芽增殖系數(shù)，并觀察芽的生長情況，結(jié)果見表3。

平均生長率結(jié)果(表4)表明，試驗(yàn)的3種因素的各個(gè)濃度均能促進(jìn)達(dá)烏里芯芭無菌苗的生長。無菌苗生長30 d后平均生長率在7.03～18.14之間。直觀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種因素對(duì)達(dá)烏里芯芭平均生長率的影響順序?yàn)锳(6-BA)>B(IAA)>C(KT)，且3種因素濃度的升高均有利于促進(jìn)達(dá)烏里芯芭無菌苗的生長。達(dá)烏里芯芭的最佳繁殖培養(yǎng)基為A3B3C3，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。芽增殖系數(shù)結(jié)果(表5)表明，3種因素的各個(gè)濃度均能促進(jìn)達(dá)烏里芯芭芽增殖系數(shù)的提高。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，接種到繁殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后的芽增殖系數(shù)在12.6～25.8之間，芽增殖系數(shù)最高的是8號(hào)培養(yǎng)基，為25.8。3種因素對(duì)達(dá)烏里芯芭芽增殖系數(shù)的影響順序?yàn)锳(6-BA)>C(KT)>B(IAA)，且6-BA和IAA濃度的升高有利于促進(jìn)芽增殖系數(shù)的提高，但KT對(duì)芽增殖系數(shù)的影響無明顯規(guī)律。達(dá)烏里芯芭最佳繁殖培養(yǎng)基為A3B3C1，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.1 mg/L KT。

比較分析發(fā)現(xiàn)，平均生長率的提高與芽增殖系數(shù)的提高并不完全同步，如9號(hào)培養(yǎng)基的平均生長率最高，達(dá)到18.14倍，但芽增殖系數(shù)為20.5，低于6、7、8號(hào)培養(yǎng)基的芽增殖系數(shù)。但在試驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)，平均生長率較低的情況下，如果芽增殖系數(shù)過高，容易導(dǎo)致叢生芽細(xì)小、纖弱，容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，不利于繼代培養(yǎng)，也不利于后續(xù)的生根移栽。因此，綜合考慮試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為達(dá)烏里芯芭最佳的繁殖培養(yǎng)基以9號(hào)培養(yǎng)基A3B3C2為宜，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.2 mg/L KT。

3.3 外源激素對(duì)達(dá)烏里芯芭生根的影響

生長健壯的叢生芽接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d各處理生根情況見表6。達(dá)烏里芯芭在添加不同濃度NAA和IAA的1/2MS培養(yǎng)基上均可生根，且隨著NAA和IAA濃度的升高，生根率升高。比較2種激素的生根率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IAA更有利于達(dá)烏里芯芭試管苗的生根，培養(yǎng)基中添加NAA的最高生根率為83.33%，出現(xiàn)在NAA濃度為1.0 mg/L時(shí)；培養(yǎng)基中添加IAA的最高生根率為93.33%，同樣在IAA濃度為 1.0 mg/L 時(shí)。添加IAA培養(yǎng)基的試管苗較為健壯，根系較為發(fā)達(dá)，但添加NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)材料的根系不發(fā)達(dá)，較為細(xì)長，且隨著NAA濃度升高出現(xiàn)愈傷組織，不利于后續(xù)的馴化移栽。因此，確定達(dá)烏里芯芭最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L IAA，在此培養(yǎng)基上獲得的試管苗植株健壯、根系發(fā)達(dá)且粗壯，移栽成活率較高。

表3 達(dá)烏里芯芭繁殖培養(yǎng)基篩選正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 達(dá)烏里芯芭繁殖培養(yǎng)基篩選平均生長率方差分析

表5 達(dá)烏里芯芭繁殖培養(yǎng)基芽增殖倍率方差分析

3.4 試管苗的移栽

根據(jù)達(dá)烏里芯芭的生長特性，將生根的健壯試管苗在室溫下開蓋煉苗3～4 d，再洗凈根部的培養(yǎng)基后，移栽到消過毒的沙床上，沙床隱蔽度約75%，每天早、中、晚各噴霧1次，30 d 后移栽成活率達(dá)98%。

4 討論

達(dá)烏里芯芭種子長卵形，長3.0～4.0 mm，寬2.0～2.5 mm，外種皮黃褐色，表面較光滑并具有光澤，質(zhì)地較軟，但在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)種子表面覆滿了蜂窩狀的小洞，這些特點(diǎn)導(dǎo)致種子消毒不徹底。本研究采用消毒后剝除種皮的方法對(duì)達(dá)烏里芯芭種子進(jìn)行消毒，有利于提高消毒效率，這可能是因?yàn)殡[藏在種皮內(nèi)的微生物可能并未完全被殺死，而是在消毒液的影響下暫時(shí)失去活力，剝除種皮時(shí)也將大部分暫時(shí)失去活力的微生物與種子分離開來，從而提高了消毒效果，這一處理也可為有類似特性的種子消毒提供參考。

表6 不同培養(yǎng)基達(dá)烏里芯芭生根的影響

藥用植物組織培養(yǎng)是種苗繁育最為快捷有效的途徑，目前也有多種藥用植物實(shí)現(xiàn)了組培苗的工廠化生產(chǎn)，如金線蓮、白芨、番紅花、鐵皮石斛等[9]。本研究通過組織培養(yǎng)途徑繁殖達(dá)烏里芯芭叢生芽，芽的增殖系數(shù)達(dá)到16.3～25.8。但是在進(jìn)行培養(yǎng)基篩選的取舍時(shí)，不能僅考慮芽增殖系數(shù)，還應(yīng)結(jié)合實(shí)際的生產(chǎn)需要，綜合考慮芽的生長情況以及后續(xù)的生根移栽表現(xiàn)，從中篩選表現(xiàn)最佳的培養(yǎng)基才能節(jié)省生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。因此，本研究所選出的達(dá)烏里芯芭最佳增殖培養(yǎng)基并不是芽增殖系數(shù)最高的培養(yǎng)基，而是芽增殖系數(shù)較高，叢生芽粗壯、長勢(shì)良好，適合生產(chǎn)使用的培養(yǎng)基。

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