墨蘭綠墨素與大花蕙蘭世界和平雜交種組培快繁技術

宋 蓮， 王玉英， 張宇歡， 陳淑英， 李枝林，2

(1.云南農業(yè)大學園林園藝學院花卉研究所，云南昆明 650201； 2.生物多樣性與云南特色農業(yè)協同創(chuàng)新中心，云南昆明 650201)

墨蘭(Cymbidiumsinense)別稱報歲蘭、入歲蘭，分布于中國福建、臺灣、廣東、廣西、云南、貴州、四川等省(區(qū))，花期為9月至次年3月，根長而粗壯，假鱗莖橢圓形，葉片劍形，花莖直立，高出葉面，花香濃郁，抗性強[1]。大花蕙蘭(C.hybridium)別稱西姆比蘭、東亞蘭，花期10月至次年4月，是蘭屬中一些熱帶附生種的雜種，株型高大，花大色艷，花期長、無香味，適應性強，既可盆栽，又可作切花。雜交育種是蘭花育種最傳統(tǒng)、最有效的方法，通過墨蘭×大花蕙蘭雜交獲得F1代植株，可有望選育出具有國蘭“香”、洋蘭“艷”的蘭花新品系。但是，蘭花種子相對較小，內含發(fā)育不完全球形胚，在自然條件下很難萌發(fā)，而采用離體胚培養(yǎng)[2]可解決這一難題。

目前，在墨蘭、大花蕙蘭、線藝蘭、野生碧玉蘭、墨蘭金華山×春蘭宋梅、春蘭紫萼×大花蕙蘭日本綠等蘭屬植物上有相關組培技術的報道[3-8]，但對墨蘭綠墨素與大花蕙蘭世界和平的F1后代組織培養(yǎng)技術研究尚未見報道。因此，本研究以墨蘭綠墨素與大花蕙蘭世界和平雜交種原球莖為試驗材料，探索其增殖分化、不定芽增殖、生根的最佳培養(yǎng)基配方，以期為其新種質的創(chuàng)制和規(guī)?；a提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

墨蘭綠墨素(♀)與大花蕙蘭世界和平(♂)雜交種原球莖，由云南農業(yè)大學花卉研究所自主培育。試驗試劑均為市購。

1.2 方法

1.2.1 原球莖的增殖分化 選取大小相同、嫩綠且長勢良好的雜交種原球莖，剔除培養(yǎng)基、幼根和芽，接種于以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度及配比的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)(表1)及瓊脂6.5 g/L、蔗糖 30 g/L、香蕉80 g/L、活性炭0.5 g/L，pH值為5.8的培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(23±2)℃，光照度 1 800～2 500 lx。每處理45個原球莖，重復3次。培養(yǎng)45、60 d后分別統(tǒng)計增殖率、出芽數。

1.2.2 不定芽的增殖 選取生長健壯、長勢一致的不定芽，接種于以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同激素配比(表2)及瓊脂6.5 g/L、蔗糖30 g/L、香蕉80 g/L、活性炭 0.5 g/L，pH值為5.8的培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(23±2)℃，光照度 1 800～2 500 lx。每處理40個不定芽，重復3次。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計不定芽的增殖率。

1.2.3 生根培養(yǎng) 將株高為3～5 cm的無根苗接種于以 1/2MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的不同生根培養(yǎng)基(表3、表4)中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度(23±2)℃，光照度1 800～2 500 lx。每瓶5株，每處理10瓶，重復3次。接種45 d后觀察生根情況。

1.3 數據統(tǒng)計分析

采用Excel 2003軟件對數據進行整理，采用SPSS 20.0軟件進行方差分析，采用最小顯著性差異法(LSD法)對試驗數據進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對雜交蘭原球莖增殖分化的影響

由表1可見，含不同激素的培養(yǎng)基對墨蘭、大花蕙蘭雜交種原球莖增殖分化效果差異明顯；含6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基對雜交蘭原球莖的增殖相對最好，增殖率為317.77%，顯著高于其他培養(yǎng)基(P<0.05)，說明雜交蘭原球莖增殖的最佳配方為1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖3%+瓊脂6.5 g/L+香蕉80 g/L+活性炭0.5 g/L；接種后60 d，部分原球莖分化出幼芽，含6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L的培養(yǎng)基原球莖出芽率相對最高，為54.96%，顯著高于其他培養(yǎng)基處理(P<0.05)，說明原球莖分化效果最優(yōu)的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖3%+瓊脂6.5 g/L+香蕉80 g/L+活性炭0.5 g/L。

表1 不同培養(yǎng)基對墨蘭×大花蕙蘭原球莖增殖分化的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 不同6-BA濃度對雜交蘭不定芽增殖的影響

由表2可知，當NAA濃度為0.3 mg/L時，含不同濃度 6-BA 的培養(yǎng)基對墨蘭、大花蕙蘭雜交種不定芽的增殖有明顯差異，含6-BA 2.0 mg/L的培養(yǎng)基增殖率相對最高，為227.5%，顯著高于其他培養(yǎng)基處理(P<0.05)；6種培養(yǎng)基配方中，6-BA濃度在0.5～2.0 mg/L時，隨6-BA濃度的增加，不定芽增殖率升高，當6-BA濃度大于2.0 mg/L時，不定芽的增殖受到抑制；1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L+香蕉80 g/L+活性炭0.5 g/L為雜交蘭不定芽增殖的最佳配方。

表2 不同6-BA濃度對雜交蘭不定芽增殖的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對雜交蘭生根的影響

2.3.1 不同NAA濃度對雜交蘭生根的影響 由表3可見，5組培養(yǎng)基配方均能誘導墨蘭綠墨素、大花蕙蘭世界和平雜交組培苗的生根，且NAA對生根率的影響差異明顯；含NAA 0.5 mg/L 的培養(yǎng)基雜交蘭生根率相對最高，為81%，分別比含NAA 1.0、1.5、2.5 mg/L培養(yǎng)基培養(yǎng)的顯著高30.65%、24.62%、32.79%(P<0.05)，且根數多而粗，植株生長健壯。

表3 不同NAA濃度對雜交蘭生根的影響

注：-代表不生長；+代表長勢一般；++代表長勢良好；+++代表長勢健壯。下同。

2.3.2 不同活性炭用量對雜交蘭生根的影響 由表4可知，活性炭對雜交蘭生根的影響差異顯著(P<0.05)；活性炭用量為1.0 g/L時的生根率相對最高，為81%，且苗生根情況和生長情況最佳，分別比活性炭用量為0.5、0 g/L的高 24.62%、47.27%。因此，生根效果相對最好的培養(yǎng)基為 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L+香蕉80 g/L+活性炭1.0 g/L。

3 結論與討論

在蘭花組織培養(yǎng)中，最常用的培養(yǎng)基為MS、VW、KC、H、RM、White及其改良型，應用時可根據不同品種和類原球莖的形成、增殖、分化及壯苗等不同培養(yǎng)階段加以修改[9]。低鹽培養(yǎng)基有利于蘭花的生長，朱根發(fā)等認為，1/2MS培養(yǎng)基有利于大花蕙蘭的快速繁殖[10]；丁雪珍等認為，最適于墨蘭根狀莖增殖的基本培養(yǎng)基為1/2MS[11]；羅虹等在研究墨蘭的組織培養(yǎng)和快速繁殖中也使用1/2MS培養(yǎng)基[12]。

表4 不同活性炭用量對雜交蘭生根的影響

植物激素是植物新陳代謝中產生的天然復合物，植物激素的種類和濃度是影響蘭花組織培養(yǎng)的重要因素之一，很小的量就會影響植物細胞的分化、分裂、發(fā)育、形態(tài)建成、開花和結實等[13-14]。細胞分裂素的作用在于刺激細胞分裂、誘導芽的分化、促使葉片擴大和莖長高、打破頂端優(yōu)勢、促進叢生芽的形成和增殖、抑制根的生長[15]，而目前6-BA是蘭花組織培養(yǎng)中最常用的細胞分裂素之一。生長素的主要生理作用是促進生根，與細胞分裂素協同可誘導不定芽的分化、側芽的萌發(fā)與生長[16]，而NAA是蘭花組培中最常用的生長素。陳麗等認為，NAA+BA有利于墨蘭原球莖的生長、分化[17]，陳小強等在研究大花蕙蘭原球莖增殖時發(fā)現，NAA+6-BA對大花蕙蘭的增殖效果良好[18]，而一般情況下，當生長素/細胞分裂素比例高時抑制不定芽分化、促進生根，反之亦然[19]。原球莖在分化芽苗階段，由于生根數少而短，易導致煉苗時難以成活，因此，篩選最佳的生根培養(yǎng)基非常重要[20]。相關研究表明，降低6-BA濃度、適當增加NAA的濃度有助于蘭花生根。本試驗結果表明，不同的6-BA與NAA配比對墨蘭與大花蕙蘭雜交蘭的原球莖增殖與分化、不定芽增殖和生根有明顯影響，含6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基可獲得288.88%的原球莖增殖率和40.97%的分化率；不定芽增殖的最佳激素配比為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，此時NAA濃度/6-BA濃度為0.15，增殖率為227.5%，當NAA濃度/6-BA濃度>0.15時，不定芽的增殖率遞增，而NAA濃度/6-BA濃度<0.15時，不定芽的增殖率隨6-BA濃度的增加而遞減；高濃度NAA對生根有抑制作用，NAA濃度為 2.0 mg/L 時雜交蘭的生根苗數多，生根率為81%，且苗生長健壯。

香蕉對酸堿有很強的緩沖能力，能保持培養(yǎng)基pH值在5.6左右，對植物的生長、增殖具有促進作用，同時香蕉泥還能有效吸收外植體分泌的類多酚氧化物，抑制外植體的褐變、降低其死亡率。李小軍等研究發(fā)現，香蕉對霍山石斛壯苗有促進作用[21]；王玉英等在輻射誘變的線藝蘭快繁技術體系研究中加入了80 g/L香蕉泥[22]。鞏振輝等認為，適宜的生根培養(yǎng)基中添加適量的活性炭有助于生根[23-25]。本試驗在雜交蘭不同培養(yǎng)階段都添加了80 g/L香蕉泥，這有助于雜交蘭組培苗的復壯、減輕褐變現象的出現；而在生根階段加入1.0 g/L活性炭，此時雜交蘭生根率高，根數多且長。

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