我國黑木耳國認(rèn)品種種質(zhì)基礎(chǔ)及黑木耳育種技術(shù)現(xiàn)狀

龐 杰， 孫國琴， 王海燕， 于 靜， 康立茹， 謝亞杰

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030； 2.食用菌內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030)

黑木耳[Auriculariaauricular(L. ex Hook.) Underw]是我國重要的食用菌生產(chǎn)種類，隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、木耳目(Auriculariales)、木耳科(Auriculariaceae)、木耳屬(Auricularia)的可食用大型真菌，木耳屬全世界約50種，我國約10種[1]。

黑木耳在我國種植歷史悠久，早在北魏時(shí)期的《齊民要術(shù)》就記載了木耳生產(chǎn)。黑木耳生產(chǎn)規(guī)模巨大，據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計(jì)，2014年我國黑木耳產(chǎn)量為579萬t，較上一年的556.39萬t同比增長4%，生產(chǎn)規(guī)模已經(jīng)超越平菇，成為繼香菇之后的第二大食用菌生產(chǎn)種類。

黑木耳生產(chǎn)同其他的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)相同，優(yōu)質(zhì)的品種是黑木耳高產(chǎn)高效的基礎(chǔ)保障。所謂作物新品種選育就是人為的作物種質(zhì)重組，作物種質(zhì)重組的基礎(chǔ)是需要不同來源和遺傳背景的種質(zhì)資源[2]。本研究收集了23個(gè)國認(rèn)黑木耳品種的詳細(xì)信息，對我國國認(rèn)黑木耳的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行分析，旨在了解我國國認(rèn)黑木耳品種現(xiàn)狀，此外，分析了我國黑木耳育種的基本技術(shù)手段和現(xiàn)狀，為進(jìn)一步開展黑木耳育種研究提出方向。

1 國認(rèn)黑木耳品種的遺傳基礎(chǔ)

根據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心公布的黑木耳品種名單[農(nóng)技種便函(2015) 60號]，收集黑木耳國認(rèn)品種的相關(guān)信息(表1)。23個(gè)國認(rèn)黑木耳品種中，分離馴化的品種有18個(gè)，占到總品種的78.3%，雜交選育的品種有5個(gè)，僅占總品種數(shù)的21.7%。23個(gè)國認(rèn)品種中， 總體可以分為兩大群體，分別是東北群體和華中南群體。東北群體來源我國東北地區(qū)，包括的地區(qū)有黑龍江、吉林、遼寧和內(nèi)蒙古東部，品種有15個(gè)；華中南群體來源于浙江、湖南、湖北大巴山等地區(qū)，包括的品種有6個(gè)；品種H10由東北群體和華南群體雜交而成，浙耳1號品種未標(biāo)注來源地區(qū)。國認(rèn)品種中，有明確親緣關(guān)系的是黑耳5號(Au86)和黑耳4號(931)，黑耳4號以黑耳5號和黑龍江呼瑪野生黑木耳品種為親本，通過雙核菌絲脫壁再生育成?？梢钥闯?，目前我國國認(rèn)黑木耳品種以分離馴化為主，育種技術(shù)落后，品種的遺傳基礎(chǔ)較為單一。我國國認(rèn)黑木耳品種沒有明確的骨干品種。

表1 23個(gè)國認(rèn)黑木耳品種的詳細(xì)信息

2 我國黑木耳育種技術(shù)現(xiàn)狀

黑木耳是一種可食用的大型真菌，在生產(chǎn)中與植物不同的是其通過純菌絲體營養(yǎng)繁殖產(chǎn)生后代，生產(chǎn)中的菌種也不是植物學(xué)中常規(guī)定義的種子，而是一個(gè)特殊的生長狀態(tài)。但是無論如何生產(chǎn)，品種選育都是實(shí)現(xiàn)黑木耳高產(chǎn)高效生產(chǎn)的基礎(chǔ)。

2.1 組織分離

通過分析國認(rèn)品種的來源可以看出，我國國認(rèn)黑木耳品種來源絕大多數(shù)是組織分離。這是由于黑木耳物種特性和組織分離是一種簡單快捷的技術(shù)手段共同造成的。通過組織分離獲得的黑木耳純菌絲體可以直接用于生產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)可以直接用于品種的審定。所以，組織分離是獲得優(yōu)質(zhì)黑木耳種質(zhì)、品種的快捷方式。

黑木耳組織分離主要包括3種主要方式，分別是孢子分離、子實(shí)體組織分離、耳木菌絲分離。孢子分離是將黑木耳耳片簡單消毒滅菌后，懸掛在培養(yǎng)基上方，通過孢子掉落，獲得純的菌絲體；子實(shí)體分離是將黑木耳子實(shí)體消毒后，直接放置在培養(yǎng)基上萌發(fā)生長，獲得純的菌絲體；耳木分離是分離野外椴木上生長的黑木耳菌絲體，在培養(yǎng)基上獲得純培養(yǎng)，從而用于生產(chǎn)。上述技術(shù)簡單易得，是黑木耳菌種獲得和開展黑木耳新品種選育的基礎(chǔ)技術(shù)。

在黑木耳組織分離中，關(guān)鍵是組織滅菌，滅菌不到位，會影響到組織的萌發(fā)和菌絲體的最終使用。目前基本的滅菌方式有75%乙醇[3]、0.01%氯化汞[4]和2%次氯酸鈉，以及培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素、慶大霉素等抗菌藥物[3]，抑制細(xì)菌生長。此外，李曉等發(fā)現(xiàn)加入青霉素、鏈霉素不僅有抗菌作用，還能夠促進(jìn)黑木耳菌絲的萌發(fā)[5-6]，但其原因還未見報(bào)道。

2.2 雜交選育

雜交育種是一項(xiàng)成熟的育種技術(shù)，是指不同基因型的親本菌株之間通過基因的自由組合、交換或其他方式產(chǎn)生兼有雙親優(yōu)點(diǎn)的新的基因型[7]。這類型的基因重組是將雙親控制不同性狀的優(yōu)良基因結(jié)合于一體，或?qū)㈦p親中控制同一性狀的不同微效基因積累起來，產(chǎn)生在各該性狀上超過親本的類型。通常論述的雜交育種在食用菌中一般指的是單核菌株雜交育種，單核菌株雜交選育又可以分為單孢雜交、雙單雜交、多孢雜交[8]。單孢雜交指的是把從子實(shí)體中收集的單核孢子菌絲體，或者通過原生體單核化技術(shù)獲得的原生質(zhì)體單核體菌絲，將兩者中具有不同基因型或者生態(tài)型的單核體之間進(jìn)行配對雜交[9]。國認(rèn)品種滬耳4號、吉雜1號和豐收2號都是通過單孢雜交獲得。福山等采用單孢雜交技術(shù)選育出了黑木耳優(yōu)良菌種遼八號[10]；李曼霞報(bào)道，單孢雜交技術(shù)選育出了黑木耳優(yōu)良菌種陜耳1號[11]。雙單雜交也就是布勒現(xiàn)象，當(dāng)單倍體的初生菌絲與異核的非單倍體的次生菌絲發(fā)生雜交時(shí)，初生菌絲中的細(xì)胞核接受次生菌絲中的核而轉(zhuǎn)變成次生菌絲的現(xiàn)象，目前雙單雜交在金針菇上應(yīng)用較多[12]。多孢雜交顧名思義指的是將很多孢子放到一起并在同一時(shí)間內(nèi)進(jìn)行雜交，然后從中挑選雜交菌株[13]。李省印等報(bào)道了通過多孢雜交育成了黑木耳新品種陜耳3號[14]。

單核菌株雜交選育關(guān)鍵內(nèi)容是獲得有效的單核菌株及開展合理高效的配對工作。食用菌有性生殖生殖可以分為同宗結(jié)合和異宗結(jié)合，黃亞東等研究結(jié)果表明，黑木耳是一種二級性異宗結(jié)合，因此在雜交組合中有50%的可能為不育[15-16]。目前關(guān)于黑木耳單核菌種研究主要集中在如何獲得和高效鑒定方面，對于黑木耳單核菌株高效配對研究和性狀分離研究相對較少，還處在雜交育種的初級階段。韓增華等研究發(fā)現(xiàn)，熒光核染色技術(shù)可快速有效地鑒定黑木耳菌株的核相，脂酶同工酶技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地區(qū)分黑木耳單核菌株及雜交新菌株的不同核型，研究得到了1個(gè)酶帶差異顯著的黑木耳新菌株[17]。劉桂娟等研究發(fā)現(xiàn)在光學(xué)顯微鏡下通過觀察黑木耳菌絲有無鎖狀聯(lián)合來鑒定單、雙核菌絲不夠準(zhǔn)確，光學(xué)顯微鏡鏡檢不能作為鑒定菌株單、雙核的唯一依據(jù)，結(jié)合雙重?zé)晒馊旧R檢能更準(zhǔn)確地鑒定菌株鎖狀聯(lián)合的有無；并且提出了雜交菌株真實(shí)性鑒定法[1]。張偉琳利用HW5號和139號2株遠(yuǎn)源性大的優(yōu)良黑木耳菌種作為親本菌株制備原生質(zhì)體菌株和孢子菌株，利用熒光顯微鏡和簡單重復(fù)序列(ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)以及酯酶同工酶法來確定菌株單、雙核及交配型，分別獲得20個(gè)孢子單核菌株和2種交配型的原生質(zhì)體單核菌株，用這2種單核菌株進(jìn)行配對雜交，最終共獲得6個(gè)雜交菌株[18]。韓增華等研究發(fā)現(xiàn)，酯酶同工酶譜及RAPD圖譜結(jié)果可以將互補(bǔ)型條帶和親本條帶清晰明確地區(qū)分開來，單核體單-單雜交獲得核型為A1B2的雜交菌株，與親本981的相似度高于親本8808[19]。

2.3 原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合育種也可以理解為雜交育種，但其育種所用的材料是食用菌菌絲體生長的一個(gè)特殊階段或者是通過技術(shù)手段從正常菌絲體細(xì)胞中獲得的。國認(rèn)菌種黑耳4號(931)(國品認(rèn)菌2007019)就是通過原生質(zhì)體融合育種技術(shù)獲得。所謂原生質(zhì)體融合育種技術(shù)指的是將具有遺傳差異的沒有細(xì)胞壁的單核原生質(zhì)體，在融合劑的誘導(dǎo)下完成融合，使基因組發(fā)生部分或全部的交換和重組[20]。單核原生質(zhì)體的來源可以分為自然產(chǎn)生的單核原生質(zhì)體和人工處理產(chǎn)生的單核原生質(zhì)體。自然生長狀態(tài)下，異宗結(jié)合的蕈菌都具有原生質(zhì)體單核化的現(xiàn)象，通過分離得到這些單核原生質(zhì)體，并將單核原生質(zhì)體應(yīng)用在遺傳育種之中[18]。人工處理產(chǎn)生單核原生質(zhì)體就是通過蝸牛酶液、溶壁酶液及果膠酶液等分解細(xì)胞壁[21]，從而獲得單核原生質(zhì)體。大量學(xué)者對黑木耳原生質(zhì)體制備等技術(shù)開展了研究[22-27]，唐玉琴報(bào)道，通過原生質(zhì)體技術(shù)選育出了黑木耳新品種雙高一號[28]。

邱敦蓮等認(rèn)為，茶樹菇單核原生質(zhì)體產(chǎn)生的同一交配型群體中，群落形態(tài)、菌絲生長速度、羥甲基纖維素酶相對活性和酯酶同工酶形狀都具有相對的穩(wěn)定性，變異范圍小，說明親本形狀不易在原生質(zhì)體中分散和稀釋，在育種程序中可以從一個(gè)比較小的變異范圍內(nèi)選擇具有親本形狀的不育單核體，有效地克服了傳統(tǒng)育種過程中由孢子單核體遺傳多樣性所造成的親本形狀分散和選材困難的障礙，減少了篩選雜交后代的工作量[29]。譚琦等利用RAPD技術(shù)，對香菇孢子單核體和原生質(zhì)體單核體的遺傳差異變化進(jìn)行了分析，結(jié)果表明以交配型基因?yàn)闃?biāo)記的孢子單核體遺傳變異大于原生質(zhì)體單核體，同種交配型的孢子單核體遺傳相似性分別為66.3%、71.7%，而原生質(zhì)體單核體的遺傳相似性分別為98.7%、93.7%[30]。因此，通過原生質(zhì)體單核化可以獲得更接近親本形狀的育種材料，可以更快速地將一些優(yōu)良形狀整合在一起，從而獲得優(yōu)質(zhì)的品種。黑木耳上關(guān)于單核原生質(zhì)體遺傳變異情況的分析還未見報(bào)道。

2.4 其他育種技術(shù)

除上述主要的育種技術(shù)手段外，黑木耳育種技術(shù)還包括誘變育種和生物工程育種。所謂誘變育種利用包括物理、化學(xué)以及生物、空間等誘變因子，使原黑木耳菌種中的遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，進(jìn)而使一部分菌株的遺傳性狀發(fā)生改變的技術(shù)手段[31]。賈建航等將黑木耳等食用菌材料進(jìn)行衛(wèi)星或高空氣球搭載，通過地面研究拮抗反應(yīng)、菌絲生長速度、出菇形態(tài)等方面發(fā)現(xiàn)，高空搭載材料出現(xiàn)明顯變異，RAPD研究也證實(shí)一些搭載菌株在DNA水平發(fā)生了變異[32]。但是誘變過程中育種材料的變異方向不可控，隨機(jī)性大，經(jīng)過誘變處理后需要開展大量的試驗(yàn)進(jìn)行分析變異方向。生物工程育種是目前育種技術(shù)的前沿，在植物育種中，目標(biāo)育種成為發(fā)展的趨勢。所謂生物工程育種是在分子水平上對菌株進(jìn)行操作，獲得具有特定遺傳性狀的新菌株?；蚬こ碳夹g(shù)給黑木耳的可控育種方式開辟了新的方向，整合一些黑木耳中不具備但是對于黑木耳高產(chǎn)高效生產(chǎn)重要的基因，滿足人們及市場的需要，這種新型的可控制的育種手段將在黑木耳育種工作中發(fā)揮著極其重要的作用。但是目前，食用菌中大多數(shù)重要性狀都是數(shù)量性狀，如菌絲生長速度、生育期、子實(shí)體形態(tài)、酶活性、單菇質(zhì)量以及產(chǎn)量等，與質(zhì)量性狀不同，數(shù)量性狀受多基因控制，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，易受環(huán)境影響，表現(xiàn)為連續(xù)變異，表型和基因型間沒有明確的對應(yīng)關(guān)系，常規(guī)的育種手段難以實(shí)現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳改良[33]。

總體來說，黑木耳雜交育種技術(shù)研究相對薄弱，對雜交育種的機(jī)理機(jī)制性問題研究較少，如菌絲特性、子實(shí)體特性的孢子分離規(guī)律，目標(biāo)性狀的基因控制方式，黑木耳遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)突破等等內(nèi)容。上述研究內(nèi)容的缺失，嚴(yán)重地制約著黑木耳雜交育種的大規(guī)模開展。

3 黑木耳育種研究方向和重點(diǎn)工作

食用菌既不像細(xì)菌等原核生物，又不同于高等植物等真核生物，形成了較為特殊的遺傳行為和生活史特性[34]，但是新品種選育同樣是食用菌高產(chǎn)高效生產(chǎn)的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)和重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)階段落實(shí)黑木耳供給側(cè)改革就是要減少黑木耳生產(chǎn)數(shù)量，提高黑木耳生產(chǎn)效率，降低黑木耳生產(chǎn)成本，提高黑木耳生產(chǎn)質(zhì)量。這個(gè)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)依然要依靠優(yōu)質(zhì)的黑木耳品種。通過綜合以上信息，黑木耳育種工作的重點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：

3.1 擴(kuò)大黑木耳種質(zhì)資源種群，豐富品種的遺傳背景

種質(zhì)資源是新品種選育的基礎(chǔ)，豐富的遺傳背景是高效優(yōu)質(zhì)品種的基礎(chǔ)。目前我國國認(rèn)黑木耳品種的遺傳基礎(chǔ)主要來源于我國東北群體和華中南群體，并且兩大群體種質(zhì)資源相互雜交較少，各地區(qū)適宜的品種都是從本地區(qū)種質(zhì)資源中選育獲得，減少了種質(zhì)資源間的交流和互換。通常來講，雜交組合中較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系能夠獲得較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。因此，有必要擴(kuò)大黑木耳種質(zhì)資源的種群，豐富品種的遺傳背景，實(shí)現(xiàn)黑木耳品種的高產(chǎn)和高效生產(chǎn)。

3.2 開展黑木耳產(chǎn)量形成規(guī)律研究

產(chǎn)量形成規(guī)律是實(shí)現(xiàn)黑木耳高產(chǎn)高效栽培的基礎(chǔ)理論，只有探明黑木耳產(chǎn)量形成規(guī)律，才能指明黑木耳優(yōu)良品種選育的目標(biāo)。黑木耳產(chǎn)量形成規(guī)律內(nèi)容應(yīng)該包括黑木耳菌種活力機(jī)理、黑木耳培養(yǎng)料降解機(jī)理、黑木耳成耳生理等方面。通過探明黑木耳產(chǎn)量形成規(guī)律，有針對性地選擇菌種活力高、培養(yǎng)料降解徹底、容易出耳的種質(zhì)資源，從而選育出優(yōu)質(zhì)、高效的黑木耳品種。

3.3 開展雜交育種的基礎(chǔ)關(guān)鍵技術(shù)研究

在雜交育種中，基礎(chǔ)技術(shù)是雜交育種的中間關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探明了這些中間關(guān)鍵環(huán)節(jié)的基本原理，開展雜交組合配對只是獲得優(yōu)質(zhì)品種的重復(fù)性配對工作。在黑木耳雜交育種基礎(chǔ)研究中，目前集中在單核菌株的獲得和鑒定方面，關(guān)于單核菌種的性狀規(guī)律和單核菌株親和性方面研究較少。通過大量的基礎(chǔ)理論研究，探明黑木耳在形成孢子過程中性狀的分離規(guī)律和單核菌株親和性規(guī)律，探明優(yōu)質(zhì)性狀在原生質(zhì)體單核化過程中的分離、組織規(guī)律，以提高黑木耳優(yōu)質(zhì)菌種的育成效率。此外，開展黑木耳雜種優(yōu)勢機(jī)理、優(yōu)良性狀的基因定位和性狀控制基因分析，為黑木耳目標(biāo)育種工作奠定基礎(chǔ)。

3.4 開展黑木耳雜交品種選育研究

趙厚坤等認(rèn)為經(jīng)過多次的擴(kuò)繁，菌種就會出現(xiàn)產(chǎn)量低、品質(zhì)差、抗逆性差、發(fā)病率高，甚至不出耳的嚴(yán)重后果；經(jīng)過有性繁育出的菌種，完全可以突破母本的優(yōu)良性狀，在各方面的表現(xiàn)都優(yōu)于母本[35]。此外，雜種優(yōu)勢也是目前食用菌新品種選育的重要應(yīng)用方面。通過大力開展黑木耳雜交育種，特別是不同種群間的雜交育種，擴(kuò)大雜種優(yōu)勢，選育出優(yōu)質(zhì)、高效的黑木耳新品種。

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