椒江口海域沉積物微生物群落及其對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)

黃 備，邵君波，周 斌，孟偉杰，羅韓燕

1.浙江省舟山海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站,浙江 舟山 316021 2.杭州師范大學(xué),浙江 杭州 311121

在土壤中生活著數(shù)量龐大的微生物種群，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應(yīng)，擔(dān)負(fù)著地球碳、氮、磷、硫等物質(zhì)循環(huán)的調(diào)節(jié)器、土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化器和污染環(huán)境的凈化器等多方面生態(tài)功能，在有機(jī)污染物生物地球化學(xué)循環(huán)中起著十分關(guān)鍵的作用。微生物作為土壤生態(tài)環(huán)境的重要組成部分容易受到外源污染物影響，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性及其變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量[1]。土壤微生物不僅是有機(jī)污染修復(fù)的重要資源，也具有指示土壤污染的潛力，對(duì)土壤微生物的研究十分必要。傳統(tǒng)的對(duì)土壤微生物的研究，往往受限于微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法，據(jù)估算，每克土壤最多可能含有10億個(gè)微生物個(gè)體，100萬(wàn)種不同的微生物[2]。但是由于現(xiàn)有的技術(shù)條件的限制，在眾多的微生物中只有不到1%的微生物能夠通過(guò)培養(yǎng)的方法分離出來(lái)。因此，傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法只能作為一種輔助工具，所得結(jié)果有很大的局限性，需要結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)方法才能更客觀而全面地反映微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)信息。

宏基因組學(xué)作為分子生態(tài)學(xué)發(fā)展的典型技術(shù)策略，能夠從環(huán)境樣本中直接獲得總DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序，在整體水平解析微生物群落結(jié)構(gòu)，盡可能真實(shí)地揭示原位環(huán)境中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性，在土壤微生物多樣性研究中顯示出強(qiáng)大的功能[3]。

椒江位于臺(tái)州地區(qū)東部，為浙江省第3條大河，擁有浙江省第三大港——海門(mén)港，椒江口兩岸是中國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展最為迅速的地區(qū)之一，醫(yī)藥化工行業(yè)、港口海運(yùn)、船舶修造及水產(chǎn)品加工等多種臨海臨港工業(yè)及濱海旅游業(yè)成為椒江口經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支撐[4]。河口地區(qū)有數(shù)個(gè)濱海化工園區(qū)，現(xiàn)有33家醫(yī)化企業(yè)，占地總面積為1.77 km2，固定資產(chǎn)為34億元，有1.23萬(wàn)職工，年上繳稅收約5億元。目前，椒江的醫(yī)化行業(yè)作為生產(chǎn)特色原料藥及中間體的產(chǎn)業(yè)集聚群在全球醫(yī)化產(chǎn)業(yè)鏈中具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，已形成了8大類在國(guó)際市場(chǎng)上有影響力和控制力的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品，有40多個(gè)品種在國(guó)際市場(chǎng)上有較高占有率[5]。

研究采用基于Illumina成熟的TruSeq邊合成邊測(cè)序技術(shù)的MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)各點(diǎn)位環(huán)境微生物多樣性進(jìn)行了全面深入的調(diào)查。并應(yīng)用SPSS、CANOCO和R語(yǔ)言Vegan程序包等常用群落分析工具，對(duì)椒江河口微生物群落與環(huán)境因子(特別是典型污染物)之間的潛在聯(lián)系進(jìn)行了深入研究。分析椒江口微生物群落的結(jié)構(gòu)和空間差異，發(fā)掘其與環(huán)境的潛在聯(lián)系，以期為濱?；@區(qū)的環(huán)境評(píng)價(jià)與環(huán)境管理提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品采集

在椒江化工園區(qū)污水入?？诟浇Ｓ蛟O(shè)置了8個(gè)海域生態(tài)監(jiān)測(cè)點(diǎn)位(C0～C7)，如圖1所示。2015年4月利用專業(yè)海洋調(diào)查船“浙海環(huán)監(jiān)”號(hào)，用靜力式采泥器采集各點(diǎn)位沉積物。取表層(5 cm)泥樣于滅菌的10 mL凍存管中，-20 ℃冷凍保存并帶回實(shí)驗(yàn)室。

圖1 椒江口附近海域采樣點(diǎn)位示意圖Fig.1 Sampling sites of offshore marine area in Jiaojiang Estuary

1.2 總DNA提取

各點(diǎn)位采用TIANGEN TIANamp Soil DNA Kit試劑盒提取樣品總DNA，按標(biāo)準(zhǔn)流程操作，具體步驟為①取750 μL SA緩沖液和0.25 g玻璃珠至2 mL離心管；②在離心管中加入0.5 g沉積物樣品，渦旋混勻15 s；③再加入60 μL SC緩沖液，渦旋振蕩10 min至樣本混勻；④12 000 r/min離心1 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的2 mL離心管；⑤加入5 μL Proteinase K溶液，混勻離心，56 ℃孵育10 min；⑥加入250 μL HA緩沖液，渦旋5 s，4 ℃放置5 min；⑦12 000 r/min離心1 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的2 mL離心管，加入200 μL HB緩沖液，混勻，4 ℃放置5 min；⑧12 000 r/min離心1 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的2 mL離心管，加入1 200 μL GF緩沖液，顛倒混勻；⑨取上述溶液于CB3吸附柱中(吸附柱放入收集管)，12 000 r/min離心30 s，棄廢液，將吸附柱放回收集管；⑩向吸附柱中加入500 μL PWS漂洗液，12 000 r/min離心30 s，棄廢液，將吸附柱放回收集管；向吸附柱中加入500 μL 70%乙醇，12 000 r/min離心30 s，棄廢液，將吸附柱放回收集管；12 000 r/min離心2 min，棄廢液；將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，放入新的1.5 mL離心管中，向吸附膜的中央懸空滴加100 μL TE洗脫緩沖液，室溫放置5 min；12 000 r/min離心2 min，收集DNA溶液于離心管中，-20 ℃儲(chǔ)存待用。

1.3 測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

測(cè)序樣品交由某生物科技公司按照16S宏基因組測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)流程構(gòu)建環(huán)境微生物16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)(引物序列：341F-CCTACGGGNGGCWGCAG；805R-GACTACH VGGGTATCTAATCC)測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，應(yīng)用Illumina MiSeq雙末端(250 bp×2)測(cè)序平臺(tái)完成序列測(cè)定。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

1.4.1 質(zhì)量控制

原始測(cè)序數(shù)據(jù)首先應(yīng)用FASTQC檢查測(cè)序質(zhì)量；然后用PRINSEQ及Fastx toolkit進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，除去低質(zhì)量的reads，修剪接頭序列，并除去修剪后非常短的讀??；然后在FLASH中進(jìn)行序列融合；最后導(dǎo)入mothur篩查并去除嵌合體序列。

1.4.2 生物信息學(xué)分析

通過(guò)預(yù)處理獲得的高質(zhì)量序列應(yīng)用mothur按97%序列相似度劃分可操作分類單位(OTU)，計(jì)算α、β多樣性指數(shù)并繪制稀釋曲線，同時(shí)比對(duì)Silva v123數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類學(xué)分析。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)獲取的OTU及種類組成數(shù)據(jù)，結(jié)合環(huán)境因子，應(yīng)用SPSS、R語(yǔ)言vegan程序包等軟件，分析椒江口微生物群落的結(jié)構(gòu)和空間差異，發(fā)掘其與環(huán)境的潛在聯(lián)系。

1.5 海域生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)

椒江化工園區(qū)排污口附近海域生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)內(nèi)容包括水質(zhì)、底泥微生物和海洋生物。水質(zhì)調(diào)查項(xiàng)目：pH，化學(xué)需氧量，無(wú)機(jī)氮(硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮)，活性磷酸鹽，石油類，汞，砷，銅，鎘，鉛，鋅，揮發(fā)性有機(jī)物和半揮發(fā)性有機(jī)污染物等；海域沉積物調(diào)查項(xiàng)目：粒度、石油類、汞、砷、銅、鎘、鉛、鋅、鉻、有機(jī)碳、總氮、總磷、硫化物、有機(jī)氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴。監(jiān)測(cè)采樣和分析方法按《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》(GB 17378—2007)和《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB 12763—2007)進(jìn)行，并全程實(shí)施了質(zhì)量控制。

2 結(jié)果與討論

2.1 海域沉積物微生物群落

2.1.1 序列統(tǒng)計(jì)

共獲得椒江口海域8個(gè)點(diǎn)位沉積物微生物原始序列861 685對(duì)(pair-end reads)，點(diǎn)位間序列數(shù)介于67 653～194 386條之間，序列平均長(zhǎng)度為462 bp。所有原始序列均提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄號(hào)為SRP067730。經(jīng)質(zhì)量控制和序列優(yōu)化，篩選出156 367條高質(zhì)量序列?？紤]到各點(diǎn)位測(cè)序數(shù)據(jù)差異較大，進(jìn)一步隨機(jī)抽樣將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以平衡采樣誤差對(duì)后續(xù)分析的影響。原始序列通過(guò)預(yù)處理，按97%序列相似度進(jìn)行劃分，共得到564個(gè)OTU，其詳細(xì)分布見(jiàn)表1。

表1 海域沉積物微生物序列信息統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用mothur軟件對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線,見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，C0、C1、C2 3個(gè)河口點(diǎn)位曲線趨向平坦，而剩余點(diǎn)位也接近于拐點(diǎn)，這與原始序列數(shù)的分布情況一致，同時(shí)也說(shuō)明各點(diǎn)位取樣數(shù)量合理，尤其在C1、C2點(diǎn)位，OTU取樣已達(dá)到飽和。

圖2 海域沉積物微生物稀釋曲線Fig.2 Rarefaction of marine sediment microbes

2.1.2 微生物種類組成

在椒江海域沉積物中鑒定得到古菌和細(xì)菌共33門(mén)275科396屬478種。變形菌門(mén)在各點(diǎn)位均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，其序列數(shù)占總數(shù)的62.1%。其他較為豐富的門(mén)類包括綠彎菌門(mén)，占6.2%；放線菌門(mén)，占5.9%；擬桿菌門(mén)，占5.9%。各點(diǎn)位門(mén)類組成詳見(jiàn)圖3。

圖3 海域沉積物微生物種類組成Fig.3 Species composition of marine sediment microbes

2.1.3 微生物多樣性

采用mothur軟件，按97%序列相似水平計(jì)算菌群豐度指數(shù)(Ace、Chao)、菌群多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)，并根據(jù)探測(cè)深度指數(shù)(Coverage)計(jì)算結(jié)果評(píng)估測(cè)序深度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各點(diǎn)位總體Ace、Chao的均值分別為511、518，點(diǎn)位間差異較小。而反映菌群多樣性的Shannon均為5.0左右，Simpson接近于0.02，顯示出C0～C7各點(diǎn)位微生物多樣性較高，且差異較小。各點(diǎn)位Coverage均超過(guò)0.99，說(shuō)明各樣品文庫(kù)的覆蓋率較高，樣本中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率極低，進(jìn)一步證實(shí)了稀釋曲線的結(jié)論。

表2 海域沉積物微生物多樣性指數(shù)

2.2 海域環(huán)境因子

按1.5節(jié)描述的方法開(kāi)展研究海域環(huán)境調(diào)查，其中幾項(xiàng)主要因子監(jiān)測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3 主要環(huán)境因子監(jiān)測(cè)結(jié)果

注：“*”為五氯聯(lián)苯(PCB101)，是一種常見(jiàn)的多氯聯(lián)苯(PCBs)。

2.3 對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)

應(yīng)用Canoco軟件，首先對(duì)微生物群落組成進(jìn)行降趨對(duì)應(yīng)分析(DCA)，計(jì)算得海域沉積物微生物群落中最大梯度長(zhǎng)度值分別為0.408，因此選擇冗余性分析(RDA)進(jìn)一步開(kāi)展環(huán)境因子與微生物群落的多元統(tǒng)計(jì)分析，并采用蒙特卡洛置換檢驗(yàn)(9 999次)對(duì)排序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

通過(guò)微生物門(mén)類多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在RDA排序圖中，第1軸和第2軸分別解釋了總變異的58.1%和18.9%(圖4)。蒙特卡洛排序檢驗(yàn)表明，PCB101(F=7.36，P=0.01)、鹽度(F=3.32，P=0.021)、γ-氯丹(F=2.93，P=0.006)對(duì)微生物門(mén)水平的群落分布具有顯著性影響。

圖4 沉積物微生物組成與環(huán)境因子RDA排序Fig.4 RDA ordination of marine sediment microbes composition and environmental factors

變形菌門(mén)、放線菌門(mén)等多個(gè)類群在C0、C1、C2 3個(gè)近河口點(diǎn)位顯示出明顯的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，古菌、螺旋體門(mén)和藍(lán)藻門(mén)則在遠(yuǎn)離河口(如C5、C6、C7)點(diǎn)位聚集。重金屬、多氯聯(lián)苯、有機(jī)氯化合物由河口向外海表現(xiàn)出濃度減少的趨勢(shì)，證實(shí)了陸源污染對(duì)該海域生態(tài)環(huán)境影響的重要性。

通過(guò)計(jì)算微生物門(mén)類組成與環(huán)境因子間Spearman相關(guān)系數(shù)并繪圖(圖5)可見(jiàn)，溫度、鹽度、pH與多個(gè)微生物門(mén)類的組成和分布呈現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系，證實(shí)河口區(qū)域環(huán)境特征的獨(dú)特性及由淡水向海水環(huán)境過(guò)渡區(qū)域沉積物微生物群落與所棲息環(huán)境的緊密聯(lián)系。結(jié)果顯示，多個(gè)待定菌群(如OD1、OP11、TM7、WS6)均與重金屬、多環(huán)芳烴化合物及滴滴涕濃度呈顯著正相關(guān)，反映出這些稀有類群微生物對(duì)特征污染物的指示意義，也反映了其對(duì)典型污染物的潛在降解或吸附能力。

圖5 沉積物微生物組成與環(huán)境因子Spearman相關(guān)系數(shù)示意圖Fig.5 Spearman correlation of marine sediment microbes′ composition and environmental factors

3 討論

海洋沉積物是地球上最復(fù)雜的微生物棲息地，它是集化學(xué)物質(zhì)和微生物于一體的特殊生態(tài)環(huán)境，海洋沉積物中蘊(yùn)藏著豐富的微生物種質(zhì)和基因資源[6]。作為高壓、高鹽的特殊生境，沉積物中更可能富集功能特異的微生物類群，有研究表明，海洋微生物種類可能高達(dá)1 000萬(wàn)[7]。海洋沉積物細(xì)菌群落是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在海洋碳、氮、磷、硫等生源要素的礦化和循環(huán)中具有關(guān)鍵作用[8]。

眾多學(xué)者對(duì)中國(guó)近海沉積物微生物群落進(jìn)行了研究。孫靜等同樣利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)中國(guó)黃東海近岸海域沉積物樣品原核微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行研究，共獲得74個(gè)門(mén)類，其中變形菌門(mén)、浮霉菌門(mén)和泉生古菌門(mén)所占比例相對(duì)較高，分別占總數(shù)的44%、11.2%和9%，變形菌門(mén)在37個(gè)沉積物樣品中均是優(yōu)勢(shì)類群[9]。昝帥君應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)在遼河口沉積環(huán)境細(xì)菌群落的研究中，共發(fā)現(xiàn)30個(gè)群落類群，其中最大的優(yōu)勢(shì)群落為變形菌門(mén)，占總?cè)郝涞?0%左右；其次為藍(lán)藻門(mén)，占總?cè)郝?0%左右；放線菌門(mén)占比為10%左右，其他群落占比約為10%[10]。同樣，方蕾等[11]在遼寧盤(pán)錦雙臺(tái)口濱海濕地沉積物的細(xì)菌多樣性研究中，鑒定出24門(mén)，其中最大的優(yōu)勢(shì)群落為變形菌門(mén)，占總?cè)郝涞?3%。宋志剛等、劉欣等、張健等[12-14]分別利用PRC-DGGE等技術(shù)對(duì)中國(guó)近岸海域進(jìn)行了表層沉積物多樣性研究，結(jié)果表明變形菌門(mén)在黃海、東海及膠州灣海域沉積物樣品中均是最大的優(yōu)勢(shì)類群。本研究結(jié)果與上述研究有相似之處，變形菌門(mén)在各點(diǎn)位均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，其序列數(shù)占總數(shù)的62.1%。但本研究發(fā)現(xiàn)的微生物門(mén)類數(shù)為33個(gè)，小于黃東海的調(diào)查結(jié)果，門(mén)類數(shù)及變形菌門(mén)所占比例與遼河口的調(diào)查結(jié)果非常接近，這是由于2個(gè)海域自然環(huán)境比較接近。但除了變形菌門(mén)這個(gè)最大的優(yōu)勢(shì)群落外，其他主要類群在各研究中均不盡相同，顯現(xiàn)出中國(guó)沿海沉積物微生物群落豐富的多樣性。

PCB101是一種常見(jiàn)的PCBs組分，在環(huán)境中檢出率高、含量高且較難降解，是公認(rèn)的一類最復(fù)雜的內(nèi)分泌干擾物[15]。椒江工業(yè)園區(qū)是浙江省經(jīng)濟(jì)建設(shè)的重要區(qū)域，研究證實(shí)PCBs各組分含量長(zhǎng)期居高不下，有機(jī)污染問(wèn)題不容忽視[16-17]。該次監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，PCB101在C0、C1、C2 3個(gè)河口點(diǎn)位均有檢出，平均濃度占總PCBs含量的13.7%。γ-氯丹是一種有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑，為深琥珀色黏性液體，常用于殺滅地下害蟲(chóng)(如螻蛄、地老虎、稻草害蟲(chóng)等)，對(duì)防治白蟻效果顯著。由于河流的遷移運(yùn)輸，椒江河口海域常出現(xiàn)有機(jī)氯農(nóng)藥的高值區(qū)[18]。該次監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，γ-氯丹在C1～C4點(diǎn)位均有檢出，平均濃度占總有機(jī)氯含量的20.2%，僅次于p，p’-DDE(39.6%)和p，p’-DDD(38.2%)，且各點(diǎn)位間差異顯著，C2點(diǎn)位達(dá)到最高值0.77 mg/kg，其余3個(gè)點(diǎn)位均在0.10 mg/kg左右。持續(xù)性的陸源有機(jī)氯輸入對(duì)河口生態(tài)環(huán)境造成直接影響，雖然中國(guó)已陸續(xù)禁用部分有機(jī)氯農(nóng)藥，但在沿海海域有機(jī)氯農(nóng)藥經(jīng)常性地被檢測(cè)出，因此開(kāi)展沉積物環(huán)境殘留有機(jī)氯化合物的微生物降解及其生態(tài)影響研究仍具有重要意義。國(guó)內(nèi)很多學(xué)者對(duì)持久性有機(jī)污染物的海洋微生物降解進(jìn)行了深入研究[19]，但有關(guān)海洋微生物群落對(duì)污染物濃度的響應(yīng)還未見(jiàn)報(bào)道，本研究揭示了PCB101、γ-氯丹等對(duì)微生物門(mén)類分布有顯著影響。

河口的環(huán)境特征異常復(fù)雜，那些在淡水與海水中具有顯著差別的環(huán)境因子很有可能使其他一些因素對(duì)微生物群落變化的影響變得更為模糊。研究在海域沉積物各點(diǎn)位觀察到明顯的自河口內(nèi)側(cè)向外海的鹽度梯度。鹽度是近岸海域解釋生物群落變化最重要的環(huán)境因子。有研究證實(shí)，椒江河口變形菌門(mén)和放線菌門(mén)的不同類群受鹽度支配分別占據(jù)淡水和海水區(qū)域，氨氧化菌的分布也受到鹽度的顯著影響[20]。昝帥君的研究揭示，遼河口沉積環(huán)境細(xì)菌群落多樣性隨鹽度遞減。本研究表明，鹽度和pH與多個(gè)微生物門(mén)類的組成和分布呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，但由于河口環(huán)境復(fù)雜多變，要厘清自然環(huán)境因子與典型有機(jī)污染物對(duì)微生物組成和分布的各自影響和特征，需要繼續(xù)開(kāi)展分析研究。

4 結(jié)論

1)應(yīng)用Illumina MiSeq宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)，在椒江口海域沉積物中鑒定得到古菌和細(xì)菌共33門(mén)類，變形菌門(mén)為明顯的優(yōu)勢(shì)門(mén)類，其序列數(shù)占總數(shù)的62.1%。其他較為豐富的門(mén)類包括綠彎菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)。

2)椒江口海域菌群豐度指數(shù)Ace和Chao的均值分別為511、518，點(diǎn)位間差異較小。Shannon菌群多樣性指數(shù)均在5.0左右，Simpson指數(shù)接近于0.02，顯示出8個(gè)點(diǎn)位微生物多樣性較高，且差異較小。

3)通過(guò)微生物門(mén)類多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PCB101、鹽度、γ-氯丹對(duì)微生物門(mén)水平的群落分布具有顯著性影響。計(jì)算微生物門(mén)類組成與環(huán)境因子間Spearman相關(guān)系數(shù)并繪圖分析，溫度、鹽度、pH與多個(gè)微生物門(mén)類的組成和分布呈現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系。

[1] 陳承利,廖敏,曾路生.污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及功能多樣性測(cè)定方法[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2006,26(10):3 404-3 412.

CHEN Chengli，LIAO Min，ZENG Lusheng.Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils[J].Acta Ecologica Sinica，2006，26(10):3 404-3 412.

[2] GANS J，WOLINSKY M，DUNBAR J.Computational improvements reveal great bacterial diversity and high metal toxicity in soil[J].Science，2005，309(5 739):1 378-1 390.

[3] 隋心,張榮濤,鐘海秀,等.利用高通量測(cè)序?qū)θ∪~章濕地土壤細(xì)菌多樣性的研究[J].土壤,2015,47(5):919-925.

SUI Xin，ZHANG Rongtao，ZHONG Haixiu，et al.Study on bacterial diversity of deyeuxia angustifolia wetland by application of high-throughput sequencing technology in Sanjiang Plain[J].Soils，2015，47(5):919-925.

[4] 黃備,邵君波,周斌,等.椒江口圍填海工程對(duì)浮游動(dòng)物的影響[J].生態(tài)科學(xué),2015,34(4):86-92.

HUANG Bei，SHAO Junbo，ZHOU Bin，et al.The effect of reclamation on zooplankton in Jiaojiang Estuary[J].Ecological Science，2015，34(4):86-92.

[5] 徐穎.臺(tái)州沿?？h市區(qū)產(chǎn)業(yè)及空間發(fā)展研究[D].杭州：浙江大學(xué),2006.

[6] 秦松,丁寧.專家論海洋生物基因資源的研究與利用[J].生物學(xué)雜志,2006,23(1):1-4.

QIN Song，DING Ning.Strategies for study and utilization of gene resources of marine organisms[J].Journal of Biology，2006，23(1):1-4.

[7] SOGIN M L,MORRISON H G，HUBER J A.Microbial diversity in the deep sea and the underexplored rare biosphere[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2006,103(32):12 115-12 120．

[8] KINGHORN A D，CHIN Y W，SWANSON S M.Discovery of natural product anticancer agents from biodiverse organisms[J].Current Opinion in Drug Discovery & Development，2009，12(2):189-196.

[9] 孫靜.黃東海細(xì)菌多樣性分析及其抗菌活性的初步評(píng)價(jià)[D].天津：天津商業(yè)大學(xué),2014.

[10] 昝帥君.遼河口海水及沉積環(huán)境細(xì)菌豐度時(shí)空變化與群落結(jié)構(gòu)淺析[D].大連：大連海洋大學(xué),2015.

[11] 方蕾，陶韋，石振家，等.用宏基因組學(xué)手段研究濱海濕地沉積物的細(xì)菌多樣性[C]∥全球變化下的海洋與湖沼生態(tài)安全學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要集.南京：2014.

[12] 宋志剛,許強(qiáng)芝,魯心安,等.中國(guó)東海海洋微生物種群多樣性初步研究[J].微生物通報(bào),2006,33(1):63-67.

SONG Zhigang，XU Qiangzhi，LU Xinan，et al.A primary study on population biodiversity of marine microorganisms from East China Sea[J].Microbiology，2006，33(1):63-67.

[13] 劉欣,肖天,張文燕,等.膠州灣海域表層沉積物細(xì)菌多樣性[J].海洋科學(xué),2010,34(10):1-6.

LIU Xin，XIAO Tian，ZHANG Wenyan，et al.Diversity of bacterial community in sediments of Jiao-zhou Bay[J].Marine Sciences，2010，34(10):1-6.

[14] 張健,趙陽(yáng)國(guó),李海艷,等.黃海西北近岸沉積物中細(xì)菌群落空間分布特征[J].海洋學(xué)報(bào),2010,32(2):118-127.

ZHANG Jian，ZHAO Yangguo，LI Haiyan，et al.Temporal and spatial distribution characterization of bacterial community in sediments from the inshore of the northwest Huanghai Sea[J].Acta Oceanologica Sinica，2010，32(2):118-127.

[15] 江萍,趙平,萬(wàn)洪富,等.珠江三角洲典型地區(qū)表層農(nóng)田土壤中多氯聯(lián)苯殘留狀況[J].土壤,2011,43(6):948-953.

JIANG Ping，ZHAO Ping，WAN Hongfu，et al.Concentrations of PCBs in agricultural soils of typical regions in Pearl River Delta[J].Soils，2011，43(6):948-953.

[16] 江錦花,朱利中,張明.椒江口水體和生物體中典型有機(jī)污染物的濃度水平及來(lái)源初探[J].環(huán)境化學(xué),2006,25(5):546-549.

JIANG Jinhua，ZHU Lizhong，ZHANG Ming.Concentration and sources of typical organic contaminants in seawater，sediment and organismsin in Jiao Jiang Bay[J].Environmental Chemistry，2006，25(5):546-549.

[17] 鄒偉明,張慶紅,王曉華,等.椒江口表層沉積物中重金屬及多氯聯(lián)苯研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2014,37(增刊2):157-160.

ZOU Weiming，ZHANG Qinghong，WANG Xiaohua，et al.Research of heavy metals and polychlorinated biphenyls in the surface sediments of Jiaojiang estuary[J].Environmental Science & Technology，2014，37(S2):157-160.

[18] 蔣然,王健鑫,黃備,等.椒江口沉積物中細(xì)菌多樣性初步研究[J].海洋與湖沼,2015,46(4):887-900.

JIANG Ran，WANG Jianxin，HUANG Bei，et al.Bacterial diversity insediments in JiaoJiang River estuary[J].Oceanologiaet Limnologia Sinica，2015，46(4):887-900.

[19] 張榮秋,董純明,盛華芳,等.白令海和楚科奇海表層沉積物中多環(huán)芳烴降解微生物多樣性[J].海洋學(xué)報(bào),2014,36(4):52-61.

ZHANG Rongqiu，DONG Chungming，SHENG Huafang，et al.Biodiversity of polycyclic aromatic hydro-carbondegrading bacteria from surficial sediments of the Bering Sea and Chukchi Sea in the Arctic[J].Acta Oceanologica Sinica，2014，36(4):52-61.

[20] ATREYEE S，SHASHIKANTH G，HU Z Q.Seasonal population changes of ammonia-oxidizing organisms and their relationship to water quality in a constructed wetland[J].Ecological Engineering，2012,40(3):100-107.