GERD食管上皮組織緊密連接蛋白和氧化應(yīng)激在發(fā)病中的研究進(jìn)展

曹正一 買(mǎi)買(mǎi)提·依斯熱依力 克力木·阿不都熱依木

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是指胃十二指腸內(nèi)容物反流入食管及以上消化道所致的癥狀和并發(fā)癥的一種慢性消化系統(tǒng)疾病，包括非糜爛性食管炎（non-erosive reflux disease，NERD）、糜爛性食管炎（erosiveesophagitis，EE）、Barrett食管（Barrett'sesophagus，BE）和消化性食管狹窄（stenosis of the esophagus，SE），燒心和反流是GERD的常見(jiàn)的典型癥狀［1］。此外，患者還經(jīng)常出現(xiàn)GERD所致非心源性胸痛、慢性哮喘、慢性咽炎及心房顫動(dòng)等食管外癥狀，因患者長(zhǎng)期受上述癥狀的影響，無(wú)論是生活質(zhì)量還是經(jīng)濟(jì)壓力，都給他們帶來(lái)了很大的負(fù)面影響［2］。雖然我國(guó)還沒(méi)有明確的流行病學(xué)資料可供明確說(shuō)明GERD在我國(guó)整體的準(zhǔn)確發(fā)病率，但近10年來(lái)陸續(xù)有不同地域研究報(bào)道其發(fā)病率為2.30%～16.98%［3］。北京、上海2地調(diào)查顯示GERD患病率為5.77%［4］，我國(guó)新疆地區(qū)GERD的發(fā)病率較高，接近GERD發(fā)病率較高的部分西方國(guó)家。GERD的診治在消化學(xué)科領(lǐng)域仍存在一定的爭(zhēng)議：（1）其診斷方法有很多，目前臨床上一般是通過(guò)多種診斷方法尋求證據(jù)互相支持，綜合評(píng)估后再予以最終診斷。GERD診斷常用的方法主要有：采用GERD問(wèn)卷調(diào)查了解患者相關(guān)癥狀的頻率和嚴(yán)重程度來(lái)初步診斷，上消化道內(nèi)鏡檢查，質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitors，PPIs）試驗(yàn)性治療，食管24 h pH監(jiān)測(cè)。而目前對(duì)于診斷GERD仍缺乏真正意義上的“金標(biāo)準(zhǔn)”，依舊依靠的是多項(xiàng)輔助檢查綜合評(píng)估后予以臨床診斷。（2）因GERD病因較多，發(fā)病的過(guò)程較為復(fù)雜，整體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，所以其治療的效果也無(wú)法使患者滿意，即治療效果無(wú)法大面積覆蓋及保證質(zhì)量［1-3］。雖然目前臨床抑酸治療是治理GERD的最佳途徑，但仍有一部分的患者對(duì)其療效欠佳。因此，尋求一種客觀證據(jù)來(lái)證明該病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，進(jìn)而以該客觀證據(jù)為突破口，尋求新的治療GERD的方法和為新藥的開(kāi)發(fā)提供有力的證據(jù)支持，顯得尤為重要。

一、GERD發(fā)病機(jī)制

臨床及基礎(chǔ)研究顯示，抗反流屏障功能障礙在GERD的發(fā)生發(fā)展中起舉足輕重的作用。GERD的發(fā)生發(fā)展可能與食管防御功能（抗反流屏障、食管酸清除、黏膜抵抗力）、侵襲因素（胃酸pH值、酸分泌量、十二指腸內(nèi)容物反流）的平衡被打破有關(guān)［5］。最近的研究更是直接提供了有力的證據(jù)，胃酸侵蝕食管黏膜引起的化學(xué)性損傷，直接導(dǎo)致食管黏膜屏障功能受損，這也從直觀的視角利用微觀的角度證明食管粘膜屏障功能受損是GERD發(fā)生的重要“標(biāo)志”［6］。有學(xué)者提出，緊密連接（tight junction，TJ）蛋白可能成為GERD食管微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的客觀指標(biāo)［7］。食管上皮細(xì)胞屏障功能損傷與TJ復(fù)合物的解離或缺失有關(guān)。譚佳成等［8］研究發(fā)現(xiàn)，GERD患者食管上皮TJ蛋白表達(dá)和分布異?？蓪?dǎo)致上皮細(xì)胞間隙增寬（dilated intercellular space，DIS）。Weijenborg 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，DIS做為黏膜完整性受損的形態(tài)學(xué)特征，促進(jìn)了胃酸在黏膜下層的滲透，而滲透至黏膜下層的酸使得GERD患者酸敏感性逐漸增高。另外一項(xiàng)臨床研究也發(fā)現(xiàn)，食管上皮DIS直徑擴(kuò)大與GERD患者燒心癥狀直接顯著相關(guān)［10］。Woodland等［11］研究顯示，胃鏡下NERD患者食管黏膜組織雖然未見(jiàn)宏觀的糜爛性改變，但食管黏膜完整性的細(xì)微缺陷可能導(dǎo)致患者反流的感覺(jué)增強(qiáng)或燒心等癥狀的加重。Farré等［6］使用胃酸灌注的GERD大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，胃酸導(dǎo)致食管黏膜通透性增強(qiáng)，使細(xì)胞間間隙擴(kuò)大，從而導(dǎo)致食管黏膜破壞。

上述相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白和連接蛋白組成了復(fù)雜的蛋白連接體系，穩(wěn)定的食管連接蛋白體系各個(gè)結(jié)構(gòu)共同維持食管黏膜屏障的完整性，一旦該平衡體系被打破，將引起相關(guān)組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)而產(chǎn)生食管生理結(jié)構(gòu)損傷或臨床癥狀。基于組織基本結(jié)構(gòu)和病理學(xué)理論，即DIS將誘導(dǎo)胃酸或膽汁等胃內(nèi)容物反流到增寬的細(xì)胞間隙中，從而誘導(dǎo)黏膜本身趨化因子和細(xì)胞因子的釋放，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，最終引起食管上皮屏障功能障礙［12］。

二、TJ蛋白在GERD發(fā)生中的作用

食管黏膜與反流的食物反復(fù)長(zhǎng)期接觸，是食管抗反流屏障功能受損和腔隙反流物清除障礙所導(dǎo)致的。食管抗反流屏障功能障礙主要表現(xiàn)為下食管括約肌松弛和食管黏膜防御能力下降等。食管黏膜防御功能以上皮屏障來(lái)完成的，食管上皮屏障主要由上皮細(xì)胞膜和TJ蛋白構(gòu)成［13］。TJ蛋白是細(xì)胞與細(xì)胞之間相互連接的一個(gè)至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)，是由一系列跨膜蛋白與外周蛋白相互作用形成的復(fù)雜蛋白質(zhì)體系，該體系受多種信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)節(jié)。同時(shí)TJ蛋白是構(gòu)成食管黏膜機(jī)械屏障最重要的結(jié)構(gòu)，由咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudin）、胞質(zhì)緊密黏連蛋白（zonula occludens，ZOs）及連接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）等結(jié)構(gòu)蛋白和各類(lèi)連接蛋白共同組成。

1.咬合蛋白（Occludin）：Occludin是TJ重要的結(jié)構(gòu)和功能組成部分。Occludin屬于進(jìn)化上具有保守功能的一種重要基因。在人體中，Occludin蛋白的基因定位于5q13。cDNA和氨基酸序列分析研究表明，小鼠、人類(lèi)和狗Occludin基因有90%的同源性［14］。Occludin蛋白是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為65 000的跨膜蛋白，它含有4個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，把蛋白分成5個(gè)部分：2個(gè)細(xì)胞外環(huán)，位于細(xì)胞質(zhì)區(qū)的N末端和C末端以及1個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)。第1個(gè)細(xì)胞外環(huán)對(duì)細(xì)胞間的黏合具有重要作用；第2細(xì)胞外環(huán)使Occludin穩(wěn)定地組裝進(jìn)TJ；N末端和C末端對(duì)維持TJ的屏障功能具有重要作用，并且C末端可與ZO-1蛋白結(jié)合維持TJ的完整性。Occludin的主要生物學(xué)功能為柵欄功能和屏障調(diào)節(jié)功能。柵欄功能把上皮細(xì)胞質(zhì)膜分成頂側(cè)的脂質(zhì)部分和基側(cè)的蛋白部分，可以阻止2個(gè)不同功能區(qū)之間的相互彌散，有助于細(xì)胞極性的形成［15］。屏障調(diào)節(jié)功能則對(duì)分子大小、離子類(lèi)型、細(xì)胞滲透性等有選擇性，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞問(wèn)小分子的運(yùn)輸，維持組織穩(wěn)態(tài)。Occludin的磷酸化調(diào)控機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為，其磷酸化結(jié)合位點(diǎn)主要落在絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸殘基上。蛋白激酶（protein kinase，PK）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase，PP）調(diào)節(jié)Occludin絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的磷酸化和去磷酸化，從而調(diào)節(jié)TJ結(jié)構(gòu)的整合與分解。在完整的上皮組織中，Occludin蛋白的絲氨酸／蘇氨酸高度磷酸化［16-17］。研究表明，絲氨酸/蘇氨酸磷酸化可能促進(jìn)Occludin整合進(jìn)TJ結(jié)構(gòu)，從而提高TJ的完整性。實(shí)驗(yàn)研究證明，各種因素導(dǎo)致的TJ的破壞都伴有Occludin酪氨酸的磷酸化有關(guān)，Occludin酪氨酸的磷酸化能減弱其與ZO-1的相互作用，從而引起TJ的斷裂［16］。

2.閉合蛋白（Claudin）：動(dòng)物TJ蛋白中存在兩種不同于Occludin的蛋白，分別由211個(gè)和230個(gè)氨基酸構(gòu)成。經(jīng)過(guò)親水性的分析研究顯示他們均有4個(gè)跨膜區(qū)，并分別命名為Claudin-1和Claudin-1-2。目前已發(fā)現(xiàn)的Claudins家族由24個(gè)跨膜蛋白亞型組成。每一個(gè)Claudin分子均由4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成，氨基和羧基末端都在細(xì)胞內(nèi)，羧基末端富含絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基。Claudins具有2個(gè)長(zhǎng)度不相等的細(xì)胞外環(huán)系統(tǒng)，在不同Claudins分子之間，第1和4個(gè)跨膜片段及細(xì)胞外環(huán)的氨基酸序列具有高度保守性［16，18］。Claudins直接作用于緊密連接膜相關(guān)蛋白的鳥(niǎo)苷酸激酶同工酶、ZO-1、ZO-2、ZO-3及富含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白來(lái)維持緊密連接特有的柵欄以及屏障功能。多種信號(hào)分子參與緊密連接蛋白的調(diào)節(jié)，如Rho因子、Ca2＋、蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）、異三聚體G蛋白等［18］。這些分子具有兩個(gè)共同的作用靶位點(diǎn)：肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白相連并定位于從底部到頂點(diǎn)的連接復(fù)合物，肌球蛋白結(jié)構(gòu)收縮可有對(duì)緊密連接膜產(chǎn)生離心性的牽引、進(jìn)而調(diào)節(jié)緊密連接的滲透性。Claudins對(duì)細(xì)胞連接處滲透性的調(diào)節(jié)主要通過(guò)蛋白激酶途徑實(shí)現(xiàn)，蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）或PKC的活化直接作用于Claudins上特定氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸）靶點(diǎn)［15］。Claudins磷酸化后，緊密連接功能下降，表現(xiàn)為氯化物滲透性增加，可能原因是磷酸化的Claudins干擾緊密連接的形成，從而破壞細(xì)胞間緊密連接的正常功能。不同蛋白激酶作用于不同的Claudin蛋白。Claudin蛋白的表達(dá)異常可直接影響整個(gè)緊密連接蛋白系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。這種改變可以是Claudins數(shù)量上的改變，也可能是基因上的突變［17-18］。一旦緊密連接功能下降，上皮細(xì)胞的極性遭到破壞，不同液性的脂質(zhì)或完整蛋白可自由擴(kuò)散，上皮細(xì)胞兩個(gè)不同環(huán)境之間的滲透屏障同樣被受到影響，最終可直接導(dǎo)致其生物學(xué)特性的改變，甚至潛在的有害物質(zhì)或病原體進(jìn)入機(jī)體。

3.胞質(zhì)緊密黏連蛋白（zonula occludens，ZOs）：ZOs是緊密連接的結(jié)構(gòu)性蛋白，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜表面，與絕大多數(shù)TJ蛋白及細(xì)胞骨架相連。ZO蛋白屬于膜相關(guān)鳥(niǎo)氨酸激酶家族，有3個(gè)異構(gòu)體，即ZO-l、ZO-2和ZO-3，其中ZO-l相對(duì)分子質(zhì)量最大［19］。ZOs蛋白結(jié)構(gòu)相似，具有特殊的亮氨酸鋅指樣結(jié)構(gòu)。ZO-1在上皮細(xì)胞主要定位于緊密連接到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，而非上皮細(xì)胞沒(méi)有緊密連接［15］。ZO-1定位于黏附連接上，通過(guò)B鏈和d鏈間接地將鈣黏附蛋白連接到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，ZO-1氨基端直接結(jié)合到閉鎖蛋白羧基端，且ZO-1也與細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白如肌動(dòng)蛋白結(jié)合，它把閉鎖蛋白和細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白緊密連接起來(lái)，這表明ZO-1在緊密連接與細(xì)胞內(nèi)相連中起著橋梁作用。研究發(fā)現(xiàn)，ZO-1表達(dá)水平升高到正常值的3倍時(shí)，ZO-l以線型形式定位于上皮細(xì)胞，這時(shí)閉鎖蛋白不連續(xù)地存在于緊密連接，表明ZO-1對(duì)緊密連接的定位發(fā)揮重要的作用［20］。

4.連接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）：JAMs是位于極性上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處的一種蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，由2條細(xì)胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域、1個(gè)I型跨膜蛋白區(qū)、1個(gè)在羧基端具有Ⅱ型PDZ結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)尾區(qū)共同組成［16］。其在正常組織結(jié)構(gòu)維持也起著不可忽視的作用。研究表明，JAMs在毗鄰的細(xì)胞間發(fā)揮著連接作用。該蛋白集中在上皮和內(nèi)皮緊密連接處，對(duì)側(cè)細(xì)胞膜也具有一定的定位作用［17］。JAMs也與細(xì)胞極性復(fù)合物的某些成員相互作用，因此參與細(xì)胞極性的建立。由非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，aPKC）在絲氨酸285上的JAM-A磷酸化與排他緊密連接定位，在該位點(diǎn)磷酸化是形成功能性緊束縛中所必需的。JAMs可能對(duì)于調(diào)節(jié)結(jié)結(jié)構(gòu)中并不重要，但在粘附信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要的作用［21］。

三、氧化應(yīng)激在GERD發(fā)病中的作用

近年來(lái)的研究顯示，氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）在GERD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［22］。在正常生理狀態(tài)下機(jī)體可維持氧化/抗氧化水平的平衡，OS可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的該生理平衡失衡，引起器官或組織中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，最終產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。OS是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。由于活性氧（reactive oxygen species，ROS）過(guò)量生成或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損導(dǎo)致氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過(guò)量聚集，引起生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變形，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損害，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，結(jié)果引起組織損傷，從而對(duì)機(jī)體造成損害的病理狀態(tài)［23］。Oh等［24］研究表明，GERD發(fā)病機(jī)制由ROS介導(dǎo)的，EE大鼠模型中他們使用亞細(xì)亞蒿提取物（artemisia asiatica，DA-9601）發(fā)現(xiàn)食管黏膜ROS的產(chǎn)生被抑制，繼而有效的控制黏膜炎癥發(fā)生。核因子NF-E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid-derived factor 2，Nrf-2），以及下游基血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御機(jī)制中的重要蛋白，Nrf2/HO-1通路調(diào)控解毒酶及抗氧化應(yīng)激酶的表達(dá)［25］。有研究報(bào)道，轉(zhuǎn)錄因子Nrf-2敲除小鼠可能由于食道和前胃角化過(guò)度癥導(dǎo)致小鼠營(yíng)養(yǎng)不良而至死亡，說(shuō)明Nrf-2的活性影響了幾種鱗狀上皮基因的表達(dá)水平［26］。Chen等［25］研究了Nrf2在野生型和敲除小鼠食管屏障功能中的作用，發(fā)現(xiàn)Nrf2缺乏明顯減少跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）而無(wú)回流，提示在生理?xiàng)l件下Nrf2的基線保護(hù)作用，當(dāng)食管暴露于反流物4周后，野生型小鼠的食管上皮基底層觀察到DIS，Nrf2缺乏加重了Nrf2敲除小鼠食管上皮超微結(jié)構(gòu)的改變，這在胃食管反流的情況下尤為明顯。由于Nrf2缺乏導(dǎo)致對(duì)應(yīng)激和氧化還原酶活性下降，他們研究了8-OHDG（一種氧化性DNA損傷標(biāo)記物）在食管上皮中具有免疫染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Nrf2敲除小鼠食管上皮細(xì)胞中的8-OHDG顯著增加，食管上皮細(xì)胞間間隙顯著增加，并且電子致密物質(zhì)顯著減少。另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)，GERD小鼠模型中，Nrf2同樣也具有保護(hù)氧化損傷的作用，特別是在胃或混合返流的情況下，Nrf2缺乏進(jìn)一步減少了被回流抑制的TEER［27］。這與他們之前的工作相呼應(yīng)，提示胃食管反流產(chǎn)生ROS，其最終誘導(dǎo)食管DIS，并使得食管上皮屏障功能異常。多項(xiàng)研究顯示，OS是許多病理過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，氧自由基參與RE中黏膜中的生理反應(yīng)活動(dòng)，在氧化應(yīng)激持續(xù)作用下可能會(huì)并發(fā)Barrett食管［22-23，28］。可見(jiàn)，氧化/抗氧化防御系統(tǒng)的平衡紊亂在維持食管黏膜穩(wěn)態(tài)/屏障中起關(guān)鍵作用。

四、小結(jié)

綜上，GERD患者的食管上皮存在TJ結(jié)構(gòu)和功能的異常（細(xì)胞旁通透性增加，進(jìn)而出現(xiàn)DIS）及ROS的過(guò)量產(chǎn)生，可能是GERD發(fā)生發(fā)展中的重要機(jī)制之一。但目前，臨床研究當(dāng)中食管黏膜ROS的產(chǎn)生與DIS的直接關(guān)系上的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。但一旦證明其科學(xué)性，那么為新藥的研發(fā)以及GERD的診治提供新的理論依據(jù)都是具有重大意義的，對(duì)于那些抑酸藥物等治療方法治療后效果欠佳的患者更將是大大的福音。