Nkx2-5與竇房結(jié)發(fā)育及相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

楊安康 諶晶晶 黃從新

Nkx2-5是NK型同源盒基因家族Nkx2型成員 ，最初人們是通過果蠅克隆出NK型同源盒基因，繼之分離出與果蠅背側(cè)血管/心臟發(fā)育密切相關(guān)的Nk-2型基因-tinman，Nkx2-5與tinman高度同源，屬于脊椎動物心臟前體細胞分化的早期標(biāo)志之一 。

最近Protze等[1]通過對發(fā)育信號通路進行階段性調(diào)控，使人類多功能干細胞產(chǎn)生了竇房結(jié)樣起搏細胞。該研究基于Nkx2-5表達與否將心肌細胞進行分類，結(jié)果顯示與表達Nkx2-5(Nkx2-5＋)的心室肌細胞相比，不表達 Nkx2-5(Nkx2-5-)的細胞與竇房結(jié)起搏細胞相關(guān)基因如Tbx18、Shox2、Tbx3以及Isl1表達水平顯著增高，起搏相關(guān)離子通道如超極化激活環(huán)核苷酸門控通道4型(HCN4)、超極化激活環(huán)核苷酸門控通道1型(HCN1)表達水平增高，Shox2＋和Tbx3＋的細胞比例也增高。該研究為何將Nkx2-5表達與否作為分類依據(jù)，Nkx2-5與竇房結(jié)發(fā)育到底存在何種關(guān)系，探究之間的關(guān)系或許可以為生物起搏研究提供新思路。

1 Nkx2-5與竇房結(jié)發(fā)育

Nkx2-5與胚胎心臟發(fā)育分化密切相關(guān)，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子是DNA結(jié)合蛋白，具有4類高度保守的結(jié)構(gòu)域，包括N端的TN(tin)結(jié)構(gòu)域、160個氨基酸組成的同源盒結(jié)構(gòu)域(HD)、位于HD下游的Nk2-SD和C端含有GIRAW保守的結(jié)構(gòu)域。其中HD可以與目的基因中相應(yīng)的啟動子結(jié)合，從而啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄[2]，Nkx2-5可與其他心臟發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子如Gata4及Tbx5等相互作用共同參與心臟工作心肌的發(fā)育，調(diào)節(jié)相關(guān)離子通道和縫隙連接蛋白在心臟工作心肌的表達，Nkx2-5則處于這些調(diào)控因子的最上游。Wu等[3]通過慢病毒介導(dǎo)使Nkx2-5過表達于體外培養(yǎng)的小鼠胚胎第10天的心肌，可見Nkx2-5、Gata4及Tbx5表達均顯著提高，工作心肌相關(guān)離子通道如內(nèi)向整流鉀通道(KCNJ2)、L型鈣通道(Cav1.2)和電壓敏感型鈉通道(SCN5a)表達大大增加。

Nkx2-5在心臟特異性表達，雖然在其他器官也有低度表達，如發(fā)育過程中的甲狀腺、咽、脾和胃等，但在出生后除心臟以外的其他器官，表達水平均顯著降低[4]。在竇房結(jié)發(fā)育過程中，Nkx2-5的表達也是有一定特點的，Wiese等[5]通過研究分析鼠胚不同發(fā)育時間點竇房結(jié)的形態(tài)定位和分子分布發(fā)現(xiàn)，基于關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因的不同表達，在鼠胚發(fā)育第14.5天，竇房結(jié)大體上可分為Tbx18＋/Tbx3＋/Nkx2-5-頭部和Tbx18-/Tbx3＋/Nkx2-5＋尾部，尾部Nkx2-5表達相對微弱，這或許也決定了發(fā)育成熟之后的竇房結(jié)結(jié)構(gòu)特點是有差異的，發(fā)育成熟的竇房結(jié)頭部，密集分布著起搏細胞團，是主要的起搏區(qū)，而尾部主要包含起搏細胞、心房肌細胞和一些特化的竇房傳導(dǎo)束。竇房結(jié)中分布的起搏細胞具有最高的自律性可產(chǎn)生起搏電流(If)，已證實有大量細胞離子通道構(gòu)成復(fù)雜的“膜時鐘”和“鈣時鐘”兩種震蕩機制，從而影響起搏細胞的功能[6－7]，其中超極化激活環(huán)核苷酸門控離子通道(HCN)是“膜時鐘”的重要組成部分，其亞型 HCN4在竇房結(jié)中高度表達，當(dāng)其變異時可引起家族性竇性心動過緩[8]。Mommersteeg等[9]研究顯示胚胎發(fā)育過程中Nkx2-5可抑制HCN4的表達，且對于竇房明顯邊界形成是必須的，他們研究鼠胚發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)HCN4的表達區(qū)域最初是和Nkx2-5的表達區(qū)域重合的，隨后其表達便限制于Nkx2-5陰性的靜脈桿部分區(qū)域。研究人員通過基因工程技術(shù)產(chǎn)生Nkx2-5突變鼠，發(fā)現(xiàn)Nkx2-5陰性鼠胚的HCN4異位表達于整個心管區(qū)域，Nkx2-5低表達的鼠胚未能形成明顯的竇房邊界，HCN4表達廣泛并延伸至心房區(qū)域，在竇房結(jié)外圍的竇房傳導(dǎo)束主要表達的縫隙連接蛋白40[10]，表達量也明顯減少[9]。

Nkx2-5與心房顫動(簡稱房顫)有一定相關(guān)性，2013年Huang等[11]通過對110名家族性房顫患者的基因測序發(fā)現(xiàn)與家族性房顫發(fā)生相關(guān)的雜合突變p.F145S，該突變導(dǎo)致的Nkx2-5轉(zhuǎn)錄活性降低可顯著增加家族性房顫的易感性。Mommersteeg等[12]通過基因標(biāo)記分析研究顯示，肺靜脈心肌與竇角心肌在胚胎發(fā)育過程中擁有不同發(fā)育起源，竇角心肌及其間質(zhì)前體細胞不表達Nkx2-5，而肺靜脈心肌起源的間質(zhì)前體細胞表達Nkx2-5，Nkx2-5對于肺靜脈心肌表型的維持是必須的，而Nkx2-5表達減少，可見肺靜脈心肌的表型向竇角心肌表型轉(zhuǎn)換，缺失縫隙連接蛋白40(Cx40)并且異位表達HCN4。這或許可部分解釋Nkx2-5突變與房顫相關(guān)心肌自律性增高之間的關(guān)聯(lián)性。

2 NKX2-5與竇房結(jié)發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的關(guān)系

最初的心臟發(fā)育起源于中胚層生心區(qū)，在形成心管之后，心管靜脈端的靜脈竇心肌與竇房結(jié)形成發(fā)育關(guān)系密切。竇房結(jié)細胞在哺乳動物胚胎中發(fā)育的具體時間尚不完全清楚，然而靜脈竇心肌在竇房結(jié)占了很大一部分，在鼠胚第9.5天開始分化，第11.5天便可從形態(tài)上辨認[13]。竇房結(jié)的發(fā)育形成受一系列因素影響，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響是不可忽視的，現(xiàn)在比較明確的轉(zhuǎn)錄因子有Tbx18，Tbx3，Shox2以及Isl1，它們的表達模式是動態(tài)且有差異的，對竇房結(jié)的發(fā)育也具有各自不同的影響，Nkx2-5與這些轉(zhuǎn)錄因子有著錯綜復(fù)雜的關(guān)系，研究也尚未完全透徹。

2.1 Tbx18 Tbx18是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族Tbx1亞族中的一員，在眾多調(diào)控竇房結(jié)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子中，其處于相對上游的地位。Christoffels等[14]通過3D重建分析靜脈竇竇角心肌發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)于鼠胚第9.5天時，在流入道分布的間充質(zhì)細胞表達Tbx18，其末端毗鄰Nkx2-5＋竇角心肌，此時的Nkx2-5表達于所有c TnI＋的心肌，甚至也表達于位于原始心管背側(cè)的第二心生區(qū)Isl1＋c TnI-的心臟前體細胞，發(fā)育中的竇角區(qū)存在著Nkx2-5＋的心肌細胞和Tbx18＋的前體細胞。自鼠胚第9.5天始，Tbx18＋Nkx2-5-的前體細胞在竇角發(fā)育中開始起越來越重要作用，Nkx2-5的缺失可阻止心房基因在竇角的異位表達，而研究顯示Tbx18對于靜脈竇竇角和竇房結(jié)頭部的形成是必須的，其缺失會導(dǎo)致竇角形成障礙和頭部缺失，但是不影響竇房結(jié)尾部形成和起搏活動[5，14]。此外，Wiese等[5]還通過基因示蹤技術(shù)研究顯示竇房結(jié)頭部的大部分細胞來自于Tbx18＋的前體細胞。培養(yǎng)來自生心區(qū)后部間充質(zhì)的Tbx18＋細胞，可見其能夠分化為具有自律性和起搏細胞特征的HCN4＋細胞。Kapoor等[15－16]研究發(fā)現(xiàn)Tbx18在抑制與工作心肌相關(guān)的縫隙連接蛋白43和基因的表達方面有重要作用，他們將轉(zhuǎn)錄因子Shox2、Tbx3、Tbx5以及Tbx18分別經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細胞，結(jié)果顯示Tbx18不需要其他細胞因子參與便可實現(xiàn)向起搏樣細胞的誘導(dǎo)，產(chǎn)生的起搏樣細胞可表現(xiàn)自律性并具有起搏細胞形態(tài)特點[16]。大量研究證實Tbx18有誘導(dǎo)細胞向起搏樣細胞分化的巨大潛力，Mei等[17]將Tbx18基因?qū)胧笾靖杉毎⑴c新生乳鼠心肌細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Tbx18可促使脂肪干細胞HCN4表達增加且產(chǎn)生If。Chen等[18]通過沉默小鼠棕色脂肪干細胞的Tbx18，發(fā)現(xiàn)棕色脂肪干細胞向起搏樣細胞的分化受到阻礙，Tbx3、Shox2、c TNT、HCN4和Cx30.2表達均明顯降低。

目前尚無足夠證據(jù)表明Nkx2-5與Tbx18之間存在轉(zhuǎn)錄方面的直接相互作用，Christoffels等[14]的研究顯示從發(fā)育角度而言，兩種轉(zhuǎn)錄因子似乎是不相關(guān)的，因為尚未發(fā)現(xiàn)兩者會同時存在于同一時期的胚胎前體細胞中，同時在Nkx2-5與Tbx18突變體中，Tbx18與Nkx2-5的表達也是各自不受影響的。

2.2 Tbx3 Tbx3是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，其表達于鼠胚第8.5天時便可在心臟流入道和咽頭區(qū)觀測到，它與傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)。在心臟發(fā)育過程中，三維重建分析顯示從鼠胚第9.5天往后可見Tbx3的表達主要局限于房室流入道，竇角區(qū)和竇房結(jié)形成區(qū)等傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生部位[19]。從鼠胚第10.5天之后，在右側(cè)竇角邊緣處可初見原始的竇房結(jié)表達Tbx3而不表達Nkx2-5，Nkx2-5的表達對于工作心肌標(biāo)志物Cx40和Nppa的基因活動是必不可少的，可見與之相對的Nkx2-5＋心肌大量表達著Cx40及Nppa[9]，而Tbx3并不調(diào)控竇房結(jié)細胞生長和形態(tài)，作用主要是確保竇房結(jié)細胞受正確的基因調(diào)控。Hoogaars等[20]通過增強小鼠胚胎期Tbx3功能，發(fā)現(xiàn)Tbx3主要作為轉(zhuǎn)錄抑制物阻遏工作心肌細胞基因表達程序在竇房結(jié)中表達，從而間接促進起搏細胞基因表達程序，比如促進低傳導(dǎo)性的Cx45、Cx30.2編碼，在其缺失的情況下，竇房結(jié)形態(tài)正常，起搏細胞會失去它獨特的基因表達程序，向更具有心房心肌細胞特征的方向表達。此外，Bakker等[21]通過他莫昔芬誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因工程鼠使其心室肌異位表達Tbx3，實現(xiàn)了使之心室肌細胞向起搏樣細胞的分化，Cx40、Cx43以及離子通道電壓敏感型鈉通道(INa)和內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)基因表達水平降低。Wiese等[5]研究通過對Tbx18及Tbx3雙基因和單基因突變轉(zhuǎn)基因鼠胚的研究發(fā)現(xiàn)，Tbx3主要在竇房結(jié)功能完善中起著重要的作用，與上述Tbx18在竇房結(jié)發(fā)育中可能存在著序貫作用，主要在Tbx18參與調(diào)控竇房結(jié)尤其是頭部的形成之后發(fā)揮作用，兩個基因之間的作用是非同步且各自獨立的。

Tbx3在竇房結(jié)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，與Nkx2-5之間存在著相互抑制作用，Wu等[3]使Tbx3的條件性失活可引起Nkx2-5在竇房結(jié)中的異位激活表達，他們發(fā)現(xiàn)高度表達于竇房結(jié)的Baf 250a，可激活Tbx3，它們兩者可與組蛋白去乙?；?存在協(xié)調(diào)作用從而可抑制Nkx2-5的表達，擾亂他們?nèi)咧g的協(xié)調(diào)作用可促進竇房結(jié)中Nkx2-5的表達，從而促進工作心肌基因表達程序在竇房結(jié)中的表達。此外，他們還通過ChIP-qPCR方法證實了Tbx3可直接結(jié)合Nkx2-5啟動子從而影響其表達。Mommersteeg等[9]研究表明Nkx2-5同樣可抑制Tbx3的表達，缺乏Nkx2-5的胚胎可見Tbx3異位表達于整個心管，除此之外，本應(yīng)明顯的竇房邊界也變得模糊不清，可見Tbx3和HCN4表達延伸至右房。

2.3 Shox2 Shox2從胚胎第8.5天開始出現(xiàn)于原始心管，胚胎第9.5天表達限于心臟的流入道區(qū)域，而后出現(xiàn)在靜脈竇、竇房結(jié)、靜脈瓣膜以及肺靜脈處[22]。與Tbx3相似，其可抑制工作心肌細胞的基因表達程序，并且與Tbx18相似，對于靜脈極的發(fā)育和形態(tài)發(fā)生也有重要作用。缺乏Shox2的小鼠表現(xiàn)胚胎期心動過緩，心靜脈極發(fā)育不全以及一般在起搏細胞中被抑制基因如Nkx2-5、Cx40和Cx43等基因上調(diào)[22－23]。Feng等[24]通過使犬間充質(zhì)干細胞過表達Shox2誘導(dǎo)出起搏樣細胞，該細胞顯示與竇房結(jié)發(fā)育相關(guān)基因如Tbx3、HCN4、Cx45表達水平增高，而與工作心肌細胞發(fā)育相關(guān)基因如Nkx2-5和Cx43表達水平降低。Hoffmann等[25]通過分離Shox2＋/＋和Shox2-/-轉(zhuǎn)基因鼠的胚胎干細胞，然后促使其分化，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)Shox2-/-鼠胚胎干細胞分化而來的竇房結(jié)樣細胞Shox2、HCN4、Tbx18等竇房結(jié)特異性基因表達明顯下調(diào)，而工作心肌標(biāo)志物Nppb的表達則顯著提高。

Shox2與Nkx2-5之間存在的拮抗作用可調(diào)控細胞發(fā)育方向，Ye等[26]研究顯示Shox2與Nkx2-5參與調(diào)節(jié)竇房臨界部位的起搏細胞與工作心肌細胞之間的平衡，Shox2與Nkx2-5共同表達于竇房結(jié)竇房交界處，一定水平Nkx2-5的表達對于竇房結(jié)尾部獨特的電生理特性是必須的，Shox2水平增高可促進向起搏細胞分化，反之Nkx2-5水平增高則促進向工作心肌分化。一定水平的Nkx2-5的表達對于竇房結(jié)尾部獨特的電生理特性也是必須的，然而當(dāng)Nkx2-5表達缺失或減少時，Shox2促進向起搏細胞方向的分化的作用卻變得很微弱，此外通過小干擾RNA(siRNA)沉默胚胎干細胞Nkx2-5表達可見起搏細胞標(biāo)志物HCN4表達增加。

2.4 Isl1 Isl1屬于LIM同源框基因家族，于鼠胚第9天便可表達于生心區(qū)，該轉(zhuǎn)錄因子對于第二心生區(qū)前體細胞分化是必要的，不同于第二心生區(qū)的其他部分在分化為心肌細胞的過程中表達量逐漸降低，它在流出道遠端、房間隔，竇房結(jié)以及房室結(jié)中分化過程中一直表達Isl1[27]。Weinberger等[28]認為Isl1甚至可作為成熟竇房結(jié)的標(biāo)志物。Vedantham等[29]通過RNA測序分析表明，Isl1在起搏細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控中占據(jù)著上游并發(fā)揮正性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，同時Liang等[30]認為Isl1在心臟發(fā)育的過程中對于起搏細胞的生存增殖以及功能的維持必不可少，Isl1至少調(diào)控著近三分之一的起搏細胞特異性基因，其構(gòu)建的缺乏Isl1的鼠胚顯示起搏細胞基因表達整體失調(diào)、心動過緩和竇房結(jié)畸形，對竇房結(jié)結(jié)構(gòu)功能有重要作用的因子Shox2、Tbx3和 HCN4等基因表達也顯著降低。

Nkx2-5可直接調(diào)控Isl1水平，進而下調(diào)分化為工作心肌細胞的Isl1轉(zhuǎn)錄水平。Dorn等[31]研究證明Nkx2-5可通過直接結(jié)合Isl1增強子而抑制Isl1轉(zhuǎn)錄活動，在小鼠胚胎干細胞中過表達Nkx2-5可抑制Isl1以及Isl1＋心臟前體細胞下游相關(guān)產(chǎn)物表達。Ye等[26]研究顯示Shox2也通過抑制Nkx2-5作用而促進Isl1表達。然而尚未有研究明確顯示Nkx2-5與Isl1之間相互關(guān)系對竇房結(jié)結(jié)構(gòu)和功能的影響。

3 小結(jié)

Nkx2-5在調(diào)控心臟發(fā)育分化方面具有重要作用。在竇房結(jié)發(fā)育過程中，一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，微妙調(diào)節(jié)心肌分化方向，Nkx2-5可抑制竇房結(jié)基因如Tbx3、Shox2和Isl1的表達，而Tbx3和Shox2可以抑制Nkx2-5的表達。竇房結(jié)的發(fā)育形成受眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響，它們的表達模式是動態(tài)且有差異的，對竇房結(jié)發(fā)育的作用相當(dāng)微妙[32]。目前利用轉(zhuǎn)錄因子重編程在模擬起搏細胞的表型和功能方面取得了一定效果，單迎光等[33]通過在在體經(jīng)皮微創(chuàng)注射技術(shù)將Tbx18轉(zhuǎn)入犬心肌，證實了利用轉(zhuǎn)錄因子實現(xiàn)生物起搏的可能性。深入了解轉(zhuǎn)錄因子與竇房結(jié)發(fā)育的關(guān)系對以后的研究有重要的提示作用。