間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響

韓 健，張莉蕓

作者單位:030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)附屬大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

成年人的骨質(zhì)通過不斷去除舊骨并產(chǎn)生新骨而進(jìn)行重建，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在骨重建過程中發(fā)揮著重要作用［1］。破骨細(xì)胞可誘導(dǎo)骨小梁和骨皮質(zhì)表面產(chǎn)生溝槽及隧道，隨后成骨細(xì)胞產(chǎn)生新的骨基質(zhì)填充這些溝槽。多種疾病可造成骨破壞的增加，包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、牙周炎、Paget病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA)及溶解性骨轉(zhuǎn)移等［2］。間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchyma stem cells，MSCs)為多功能基質(zhì)細(xì)胞，是一種非造血前體細(xì)胞。MSCs最初是由Friedenstein等從骨髓中分離而來，為一種成纖維樣細(xì)胞，具有在體外分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的能力，移植到體內(nèi)后可生成骨組織。研究證明MSCs可分泌影響破骨細(xì)胞形成及骨再吸收的調(diào)節(jié)因子。MSCs對(duì)破骨細(xì)胞形成的作用較復(fù)雜并且依賴于其所處的病理生理環(huán)境，其作用機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。

1 破骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞形成

破骨細(xì)胞是一種多核細(xì)胞，主要來源于骨髓造血干細(xì)胞 (bone marrow hematopoietic stem cells，BMHSCs)，也可由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分化而來，可通過溶解羥磷灰石晶體及退化的有機(jī)骨成分而促進(jìn)骨再吸收過程［3］。與巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的作用相似，骨質(zhì)中的破骨細(xì)胞具有吞噬作用，因此稱為骨特征性巨噬細(xì)胞［4］。此外，破骨細(xì)胞在病理?xiàng)l件下具有免疫調(diào)節(jié)作用，可分泌多種介質(zhì)，參與炎性骨質(zhì)丟失過程［5］，因此破骨細(xì)胞也是一種免疫細(xì)胞。

研究證實(shí)，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 受體激活蛋白 (receptor activator of NF-κB，RANK)/NF-κB受體激活蛋白配體 (receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)/護(hù)骨因子 (osteoproterin，OPG)系統(tǒng)是與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、成熟和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路。RANKL又稱為破骨細(xì)胞分化因子或OPG配體，屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor， TNF) 家 族 的 一 員［2］。RANKL是生理性骨重建過程中促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及活化的關(guān)鍵因子，通過與破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合而促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。OPG又稱為破骨細(xì)胞生成抑制因子 (osteoclastogenesis inhibitory factor，OCIF)，來源于成骨細(xì)胞及其他骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，屬于TNF受體家族中的一員，可干擾RANKL與RANK的結(jié)合，從而抑制骨的再吸收過程。因此，RANKL/OPG比值在破骨細(xì)胞形成過程中發(fā)揮著重要作用。此外，近年來的研究表明，多種促炎細(xì)胞因子亦參與了破骨細(xì)胞的形成，白細(xì)胞介素 (interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8、IL-11、IL-17及TNF-α可促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，而IL-4、IL-10、IL-13、IL-18和干擾素 (interferon，IFN)-γ及IFN-β可抑制其形成。

2 MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用

MSCs可分化為特定類型的細(xì)胞，并產(chǎn)生多種可溶性因子以介導(dǎo)損傷組織的再生及修復(fù)。已有研究表明，MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，在多種生理環(huán)境下發(fā)揮免疫抑制作用。MSCs可抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞 (natural killer，NK)及樹突狀細(xì)胞 (dendritic cell，DC) 的增生［6］。目前臨床上已將MSCs用于克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥、1型糖尿病、同種異體移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病等多種疾病的治療。

研究表明MSCs的免疫抑制活性只有在炎性環(huán)境下才會(huì)被激活［7］，IFN-γ、TNF、IL-1α 或 IL-1β等因子對(duì)MSCs有活化作用［8］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)IL-17可促進(jìn)MSCs的免疫抑制活性［9］。值得注意的是，MSCs可根據(jù)其所處環(huán)境的不同而發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用，當(dāng)其所處環(huán)境的炎癥反應(yīng)程度較輕時(shí)，MSCs可通過產(chǎn)生一些促炎因子募集免疫細(xì)胞至炎癥部位，從而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。然而，在炎癥反應(yīng)程度較重的情況下，MSCs可抑制不同免疫細(xì)胞的增生及功能，從而發(fā)揮其免疫抑制作用［10］。研究表明，口服免疫抑制劑可降低MSCs的免疫抑制作用［11］。因此，用MSCs治療自身免疫性疾病需考慮炎癥反應(yīng)程度、細(xì)胞因子類型及免疫抑制劑的使用情況等幾個(gè)因素。另有研究發(fā)現(xiàn)，人類MSCs可抑制CD34+祖細(xì)胞的分化，抑制單核細(xì)胞分化成為DC以及B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞的過程，MSCs亦可抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的分化及T細(xì)胞分化成為輔助性T17細(xì)胞?？傊琈SCs在炎癥反應(yīng)程度較輕的條件下具有免疫激活作用，而在炎癥反應(yīng)程度較重的條件下具有免疫抑制作用。

3 MSCs影響破骨細(xì)胞形成的體外研究

有研究發(fā)現(xiàn)，不成熟的基質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞不僅可促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，還可表達(dá)高水平的RANKL。一項(xiàng)將人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)同破骨細(xì)胞前體細(xì)胞 (CD34+hHSCs)共培養(yǎng)的研究表明，在缺乏糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的條件下，MSCs可促進(jìn) HSCs增生并分化成為破骨細(xì)胞。

MSCs可通過其表面蛋白質(zhì)及分泌可溶性因子以促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成。Zhu等［12］將BMMSCs同大鼠CD34+hHSCs與CD11b+單核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs可通過分泌RANKL、巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)及IL-6等促破骨細(xì)胞形成因子的方式促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。此外，Ma等［13］證明MSCs的促破骨細(xì)胞形成作用與其所來源骨髓的炎癥程度密切相關(guān)。MRL/lpr大鼠是一種慢性系統(tǒng)性炎癥及骨髓炎癥模型鼠，研究發(fā)現(xiàn)與輕度骨髓炎癥大鼠模型相比，MRL/lpr大鼠的BMMSCs促破骨細(xì)胞形成作用增強(qiáng)。但是，MSCs還具有抑制破骨細(xì)胞形成的作用。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，因此有學(xué)者認(rèn)為其可增強(qiáng)MSCs的促破骨細(xì)胞形成能力。然而，Zhu等［12］將 TNF-α 加入MSCs/單核細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)后，破骨細(xì)胞形成的數(shù)量明顯減少，并發(fā)現(xiàn)TNF-α可上調(diào)MSCs分泌OPG的能力，輕微下調(diào)MSCs分泌M-CSF、RANKL及IL-6的能力。由于RA患者的關(guān)節(jié)滑液中TNF-α表達(dá)升高，因此有研究將RA患者的關(guān)節(jié)滑液同MSCs進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的作用同滑液中TNF-α的水平顯著相關(guān)，當(dāng)滑液中TNF-α水平較低時(shí)，MSCs可促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，然而當(dāng)滑液中TNF-α水平較高時(shí)，MSCs可抑制破骨細(xì)胞形成［14］。此外，經(jīng) TNF-α刺激后的MSCs仍保留著其免疫表型、多向分化潛能及免疫抑制活性，因此TNF-α可調(diào)節(jié)MSCs對(duì)破骨細(xì)胞形成的調(diào)節(jié)作用，是一種增強(qiáng)MSCs免疫抑制作用的促炎介質(zhì)。

此外，TNF-α以外的其他因子也可能參與了調(diào)節(jié)MSCs免疫抑制作用的過程。Oshita等［15］將MSCs同外周血單核細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，并加入高劑量的 RANKL及 M-CSF，發(fā)現(xiàn) MSCs可通過分泌OPG以抑制破骨細(xì)胞的分化及活性。因此推測(cè)RANKL和M-CSF可能同TNF-α一樣調(diào)節(jié)MSCs對(duì)破骨細(xì)胞形成的作用，使其從促破骨細(xì)胞形成轉(zhuǎn)變?yōu)榭蛊乒羌?xì)胞形成。

Takano等［16］發(fā)現(xiàn)，MSCs可通過分泌 OPG及IL-10抑制破骨細(xì)胞的形成。IL-10是一種抗炎及免疫抑制因子，不僅在機(jī)體發(fā)生感染時(shí)可抑制組織損傷，還可通過抑制免疫及炎性反應(yīng)來治療自身免疫性疾病。IL-10可通過干擾RANKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制破骨細(xì)胞形成的早期階段，因此MSCs可通過分泌IL-10發(fā)揮抗破骨細(xì)胞形成的作用。此外，Takano等還發(fā)現(xiàn)MSCs亦可分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β1，。TGF-β1在破骨細(xì)胞形成及骨再吸收過程中可發(fā)揮雙相作用，即較低質(zhì)量濃度的TGF-β1可促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成及存活，較高質(zhì)量濃度的TGF-β1可抑制破骨細(xì)胞的形成并促進(jìn)其凋亡［17］。

Varin等［18］研究發(fā)現(xiàn)，MSCs對(duì)破骨細(xì)胞形成的作用是通過其表面標(biāo)志物CD200與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的CD200受體 (CD200R)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。CD200是最新發(fā)現(xiàn)的MSCs表面標(biāo)志物，是免疫球蛋白超家族的一員，可在多種細(xì)胞表面表達(dá)，發(fā)揮免疫抑制作用［19］，CD200R是一種1型跨膜蛋白，主要表達(dá)于單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面［18-19］，二者結(jié)合后可觸發(fā)免疫抑制信號(hào)途徑，從而誘導(dǎo)不同的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，并通過下調(diào)多種免疫細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞的功能而發(fā)揮抗炎作用［20］。Varin等［18］證明CD200-CD200R系統(tǒng)可通過抑制其下游的RANK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以抑制破骨細(xì)胞的形成，CD200表達(dá)陽(yáng)性MSCs的可顯著抑制破骨細(xì)胞的形成。然而，CD200表達(dá)陽(yáng)性及 CD200表達(dá)陰性MSCs均可以表達(dá)等量的OPG水平，表明CD200表達(dá)陽(yáng)性MSCs對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用并不依賴于OPG的分泌水平。上述研究使用的是加入高濃度促破骨細(xì)胞形成因子M-CSF及RANKL的培養(yǎng)基，值得注意的是MSCs是否表達(dá)CD200與其來源相關(guān)。骨髓來源MSCs可表達(dá)CD200，然而不同捐獻(xiàn)者的MSCs表面CD200表達(dá)水平并不相同。臍帶血來源的MSCs并不表達(dá)CD200［19］，胎兒的MSCs可表達(dá)CD200［21］。有研究發(fā)現(xiàn)，CD200是內(nèi)臟脂肪干細(xì)胞的潛在標(biāo)志物［22］，來源于 Wharton膠的MSCs可表達(dá)高水平的 CD200［20］。有學(xué)者對(duì) MSC表面CD200的抗炎作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)炎癥刺激后Wharton膠及脂肪來源的MSCs中CD200表達(dá)水平并無明顯變化，而BM-MSCs在受到促炎細(xì)胞因子刺激后其CD200表達(dá)水平升高，INF-α、TNF及IL-1刺激后可有輕微升高，而IFN刺激后CD200水平顯著升高［20］。因此，適當(dāng)來源的 CD200+MSC有望作為多種炎性及自身免疫性疾病的新型治療方法。

4 關(guān)于MSCs影響破骨細(xì)胞形成的體內(nèi)研究

有研究顯示，用MSCs移植治療不同的可導(dǎo)致骨代謝紊亂的炎性疾病，如原發(fā)/繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥及RA等以修復(fù)其骨質(zhì)丟失。將MSCs移植療法用于糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物，并以佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型［15］及系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型MRL/lpr小鼠［13］，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)骨基質(zhì)的形成并抑制骨再吸收過程，然而，MSCs移植的治療靶點(diǎn)尚未證實(shí)。Ma等［13］將健康人類的MSCs移植于MRL/lpr小鼠，發(fā)現(xiàn)其治療靶點(diǎn)為小鼠的BMMSCs。在SLE患者及MRL/lpr小鼠模型中，骨髓中促炎細(xì)胞因子IL-17水平升高，可促進(jìn)BMMSCs的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)能力，而 hMSCs移植后 IL-17水平降低，BMMSCs的功能恢復(fù)正常，從而維持骨質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。Park等［23］用 TGF-β 轉(zhuǎn)導(dǎo)的 MSCs對(duì) DBA/1J大鼠建立的CIA模型進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其可抑制大鼠關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展并減少骨及軟骨的破壞。此外，TGF-β轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs還可抑制破骨細(xì)胞的分化，因此推測(cè)TGF-β可誘導(dǎo) MSCs的抗破骨細(xì)胞形成能力。Koizumi等［24］將來源于骨關(guān)節(jié)炎 (osteoarthritis，OA)或RA患者的滑液間充質(zhì)干細(xì)胞移植于RA/OA患者，發(fā)現(xiàn)患者關(guān)節(jié)軟骨損傷程度明顯緩解。這些體內(nèi)研究表明，MSCs移植可通過抑制破骨細(xì)胞形成而減少受體骨與軟骨的破壞，且TGF-β轉(zhuǎn)導(dǎo)后MSCs的抗破骨細(xì)胞形成能能力增強(qiáng)。此外多項(xiàng)研究表明，將MSCs移植至野生型老鼠后并不能對(duì)其骨代謝產(chǎn)生影響，證明受體的炎性環(huán)境在MSCs移植后的骨代謝修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。

5 結(jié)論

基于上述研究結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)MSCs對(duì)破骨細(xì)胞的形成具有雙重作用，這種作用依賴于其所處的微環(huán)境。在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中不加入或僅加入少量的M-CSF及RANKL等促破骨細(xì)胞形成因子后，MSCs可刺激破骨細(xì)胞的形成。然而，在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中加入大量的M-CSF及RANKL等促破骨細(xì)胞形成因子后，MSCs可抑制破骨細(xì)胞的形成。

將TNF-α加入MSCs/單核細(xì)胞培養(yǎng)基可使得MSCs促破骨細(xì)胞形成作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?在誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的培養(yǎng)基中加入MSCs可顯著抑制破骨細(xì)胞的形成。因此，可以假設(shè)，在培養(yǎng)基中加入高質(zhì)量濃度的促破骨細(xì)胞形成因子來模擬體內(nèi)的炎性病理環(huán)境可刺激MSCs發(fā)揮其抑制破骨細(xì)胞形成作用，這種假設(shè)為治療炎癥誘導(dǎo)的骨質(zhì)丟失提供了新的思路，但其可能性有待于進(jìn)一步研究加以證明。